REZUMAT TEZEI DE DOCTORAT, STUDIUL SISTEMULUI LIMFATIC SUPERFICIAL DIN REGIUNEA MAMELELOR LA CĂłEA

Transcriere

1 REZUMAT TEZEI DE DOCTORAT, STUDIUL SISTEMULUI LIMFATIC SUPERFICIAL DIN REGIUNEA MAMELELOR LA CĂłEA Studiul sistemului limfatic, în general şi în mod special cel al glandei mamare de la specia canină, reprezintă o provocare majoră având în vedere diversitatea complexă a acestui sistem raportat la cuantumul atenuat al cercetărilor într-un domeniu atât de vast. Lucrarea de fańă realizează o abordare integrată şi totodată multilaterală a specificităńii sistemului limfatic la specia canină în deplină corelańie cu metodele moderne de investigańie asociată nivelului de cunoaştere în ansamblu. Tematica abordată este de actualitate şi ea vine să completeze lipsa de informańii din literatura de specialitate referitoare la un nou mod de interpretare al morfologiei, prin urmare al fiziologicului şi implicit, o nouă percepńie al patologicului. Obiectivul cercetărilor prezentei teze a constat în punerea în evidenńă a sistemului limfatic al glandelor mamare la căńea, folosind ca metodă principală de studiu limfografia indirectă cu ajutorul substanńelor colorante intravitale, precum şi metode imagistice de cercetare, respectiv ultrasonografia şi limfografia directă. Teza de doctorat cuprinde 212 pagini şi este structurată pe un număr de 12 capitole. Primele capitole au la bază un complex studiu, totalizând datele din 343 surse bibliografice din literatura de specialitate. Următoarele capitole se referă la contribuńiile noastre originale aduse în urma cercetărilor proprii, efectuate pe parcursul elaborării lucrării de fańă, la studiul sistemului limfatic al glandei mamare la specia canină. Astfel în primul capitol, am relevat în mod general, un scurt istoric al explorărilor sistemului limfatic, care ştiinńific a fost evidenńiat odată cu observańiile asupra animalelor, şi particular am reliefat câteva aspecte legate de modul de interpretare şi clasificare topografică utilizate în trecut. Cel de-al doilea capitol conńine date referitoare la morfologia sistemului limfatic, începând cu aspecte ale dezvoltării ontogenetice şi continuând cu morfologia specifică limfonodurilor şi vaselor limfatice. O atenńie aparte am acordat sistematicii şi topografiei limfonodurilor în vederea cunoaşterii detaliilor privitoare la norma comună atribuită speciei canine. Capitolul care dezvoltă ontogenia, morfologia şi fiziologia glandei mamare surprinde atât aspecte legate de structură, cât şi date referitoare la vascularizańia şi inervańia glandei mamare. O deosebită importanńă am atribuit rolului sistemului limfatic în patologia tumorală, insistând pe limfangiogeneza tumorală, modalităńile şi căile de diseminare a metastazelor, dezbătute pe parcursul capitolului cinci. În vederea adoptării unei metode optime de cercetare, am studiat datele bibliografice configurând principalele metode de studiu ale sistemului limfatic în capitolul următor şi am adoptat ca metodă de cercetare tehnica limfografiei indirecte. Partea originală a tezei, desfăşurată pe parcursul a 130 pagini, cuprinde scopul lucrării, materialul şi metodele de lucru, rezultatele obńinute, discuńiile şi concluziile generale ale studiului. Materialul de studiu a fost reprezentat de un efectiv de 24 căńele şi a fost distribuit pe trei screening-uri astfel: un număr de 19 căńele de rasă comună, de vârste şi greutăńi variate, au fost repartizate metodei limfografice indirecte de explorare şi 5 căńele metodelor imagistice de investigańie, şi anume, 3 căńele pentru ultrasonografie şi 2 căńele pentru limfografia directă. Metodele de cercetare utilizate au fost cele specificate mai sus, cu menńiunea că am adaptat fiecare metodă scopului cercetărilor noastre. Limfografia indirectă. Reprezintă un procedeu de punere în evidenńă atât a vaselor limfatice precum şi a limfonodurilor aferente acestora prin administrarea substanńei colorante sau de contrast în Ńesutul conjunctiv interstińial, evitându-se astfel chirurgia vaselor limfatice. În vederea realizării scopului propus, au fost fixate o serie de obiective şi anume:

2 definirea şi aprecierea comparativă a modelului vascularizańiei limfatice a glandelor mamare; sublinierea tipurilor de conexiune existente între glandele mamare adiacente şi/sau simetrice, corelate cu existenńa modelului conexional între limfonodurile simetrice; analiza sensului de drenaj limfatic cranial şi/sau caudal al glandelor mamare; precizarea stańiilor limfonodale în concordanńă cu sensul de drenaj limfatic. Astfel, noi am injectat substanńa colorantă atât subcutanat cât şi în parenchimul mamar, tocmai pentru a pune în evidenńă întreaga reńea limfatică, şi mai mult, să urmărim sensul de drenaj limfatic, precum şi stańiile limfonodale aferente. SubstanŃa colorantă utilizată a fost albastru Evans, o substanńă foarte solubilă, uşor penetrantă şi cu un marcant tropism pentru Ńesutul limfatic. În lipsa unui protocol de administrare standard, am întocmit o schemă proprie de injectare, atât în ceea ce priveşte concentrańia şi cantitatea substanńei colorante albastru Evans cât şi timpul de aşteptare în vederea citirii rezultatelor obńinute. Din aceste considerente, urmărind obiectivele cercetărilor noastre, limfografia indirectă, ca tehnică principală a studiului a fost utilizată pe 19 căńele, repartizate în 6 loturi. Astfel, pentru lotul I, s-a utilizat o concentrańie de 10% a substanńei colorante albastru Evans şi o cantitate de 2 ml, respectiv 0,5 ml pe punct injectat subcutanat şi în parenchimul glandei mamare abdominale craniale A1 drepte. Timpul de aşteptare până la citirea rezultatelor a fost de 24 de ore, când am constatat o impregnare evidentă cu albastru Evans a zonei mamare injectate. În aceste condińii nu s-a realizat o identificare a reńelei limfatice mamare, dar s-a reuşit o foarte bună evidenńiere a limfocentrilor aferenńi atât sensului de drenaj cranial, cât şi celui caudal. Prin urmare în sens cranial au fost bine conturate limfonodurile axilare proprii şi accesorii aparńinând limfocentrului axilar, limfonodurile sternale craniale stângi de pe partea opusă injectării aparńinând limfocentrului toracic ventral, colorantul ajungând până la limfonodurile cervicale profunde caudale drepte. În sens caudal, au fost foarte bine remarcate limfonodurile inghinale superficiale drepte, iliofemurale drepte, continuând cu limfonodurile aparńinând limfocentrului iliosacral, respectiv limfonodurile iliace mediale şi sacrale. De asemenea au fost profilate şi limfonodurile lomboaortice. Lotul II a beneficiat de un număr de cinci căńele, la care s-a injectat tot glanda mamară abdominală cranială A1 stângă, cu o concentrańie a substanńei colorante de 5%, însă protocolul de administrare şi interpretare a fost diferit. În acest sens, la două căńele s-a urmat acelaşi protocol al lotului I, în ce priveşte cantitatea şi interpretarea iar la trei subiecńi s-au injectat 0,8 ml per total glandă mamară, 0,2 ml într-un punct injectat, citirea rezultatelor făcându-se la 48 de ore. În concordanńă cu lotul anterior, drenajul glandei mamare luate în studiu este dublu, atât în sens cranial cât şi în sens caudal. Prima stańie limfonodală a drenajului cranial a fost reprezentată de limfonodurile axilare proprii şi accesorii de pe partea injectată la doi subiecńi, iar la alńi trei s-au identificat doar limfonodurile axilare proprii. Urmărind sensul de drenaj cranial, am remarcat colorarea limfonodurilor sternale craniale pe o singură parte, la majoritatea cazurilor pe partea stângă şi la un singur caz s-au vizualizat ambele limfonoduri sternale craniale, stângi şi drepte. Limfonodurile cervicale profunde caudale au fost prezente la patru cazuri, lipsind la cazul care avea prezente ambele grupări limfonodale sternale craniale (stângi şi drepte). Nu am sesizat colorarea limfonodurilor cervicale superficiale ci doar prezenńa acestora. Drenajul caudal a fost reprezentat de limfocentrul inghinofemural sau inghinal superficial, mai specific de limfonodurile inghinale superficiale stângi la trei subiecńi. De remarcat privitor la acest lot este prezenńa substanńei colorante, albastru Evans de o intensitate mai redusă, la nivelul limfonodurilor inghinale superficiale de pe partea opusă injectării (dreapta), la ceilalńi doi subiecńi ai studiului. Limfonodurile iliofemurale au fost vizualizate ca fiind impregnate cu albastru Evans, la un singur subiect, în schimb am remarcat o bună colorare a limfonodurilor iliace mediale de pe

3 partea injectată, cele simetrice nefiind apreciate macroscopic impregnate. De semnalat în cazul unui subiect prezenńa unui limfonod iliac medial suplimentar, iar la alt subiect a unui limfonod sacral suplimentar. Limfonodurile lomboaortice, variabile ca număr şi dimensiune au fost remarcate la tońi subiecńii fiind colorate destul de palid. Referitor la limfocentrul popliteu facem menńiunea că a fost invariabil prezent, fără a se sesiza o nuanńare, cel puńin macroscopică a limfonodurilor ce-l alcătuiesc. În acest context, facem menńiunea că la un subiect al acestui lot, limfonodurile poplitei au fost duble, iar la un altul chiar triple. Lotul III, a fost compus din cinci exemplare, la care prin tehnica limfografiei indirecte, utilizând o concentratie de 2,5%, o cantitate de 0,4 ml (0,1 ml pe punct injectat) a substanńei colorante, am evidenńiat drenajul cranial şi caudal al mamelei A1, precum şi anumite particularităńi legate de limfonodurile prezente pe sensul de drenaj şi vasele limfatice aferente. Interpretarea rezultatelor s-a realizat distinct, respectiv la 24, 48 şi 72 de ore. Astfel, am marcat încă odată ipostaza limfocentrului axilar ca primă stańie a drenajului cranial al glandei mamare abdominale craniale, mai mult, la un subiect al acestui lot am remarcat colorarea, mai estompată a limfocentrului axilar de pe partea opusă injectării. Majoritatea subiecńilor au prezentat ambele grupări limfonodale axilare (proprii şi accesorii). Sensul de drenaj cranial mai cuprinde la subiecńii acestui lot, limfonodurile sternale craniale (prezente doar pe o parte la trei subiecńi), cervicale profunde caudale (la doi subiecńi), cele cervicale superficiale fiind constant întâlnite la tońi subiecńii. În sens caudal, drenajul a fost reprezentat de limfonodurile inghinale superficiale, duble, colorate pe partea injectării, dar şi pe partea opusă la doi subiecńi. Am reuşit prin această evidenńiere să confirmăm încă odată, prezenńa vaselor limfatice ce trec planul median. Totodată am remarcat existenńa unor vase ce ocolesc limfonodurile inghinale superficiale şi se îndreaptă spre limfonodurile iliofemurale sau spre cele iliace mediale, care au fost mai difuz colorate şi pe partea opusă injectării. Limfonodurile sacrale au fost de asemenea mai slab colorate, deoarece numai o parte din aferenńe ajung la acest nivel, din limfonodurile inghinale superficiale sau iliofemurale, marea majoritate îndreptându-se spre limfonodurile iliace mediale. MenŃionăm că am remarcat prezenńa a câte un limfonod suplimentar aparńinând limfonodurilor iliace mediale şi chiar sacrale. Limfonodurile lomboaortice au fost bine impregnate cu substanńă colorantă albastru Evans, ceea ce confirmă faptul că acestea pot primi aferenńe atât de la limfonodurile iliace mediale sau iliofemurale cât şi aferenńe directe provenind de la limfonodurile inghinale superficiale. În lotul IV al studiului a fost injectată tot glanda mamară abdominală cranială A1, cu aceeaşi cantitate ca şi în lotul precedent, însă concentrańia a fost de 1%, injectările realizându-se timp de cinci zile consecutiv, urmată de interpretare la 48 de ore de la ultima injectare. În acest context observańiile noastre a avut ca primă intenńie analiza modelului vascular al glandei mamare luate în studiu. Cu toate că injectările s-au făcut seriat şi timpul de aşteptare a fost relativ suficient, am apreciat cu dificultate vascularizańia limfatică deoarece parenchimul mamar a apărut intens colorat în centru, estompându-se pe măsura îndepărtării spre periferie. Totuşi putem evalua tipul vascularizańiei ca fiind plexiform central şi reticular perimamar, urmând ca în cercetările ulterioare să definitivăm aceste aspecte. Cât priveşte sensul de drenaj cranial al mamelei A1, acesta este reprezentat, ca în majoritatea cazurilor de limfocentrul axilar. Ceea ce este particular acestui lot, este prezenńa pe lângă limfonodurile axilare proprii şi accesorii, a unui limfonod suplimentar aparńinând limfocentrului axilar, aspect nemaiântâlnit în cercetările noastre. De asemenea limfonodurile axilare proprii au fost duble la două cazuri. În aceste circumstanńe tot duble au apărut limfonodurile sternale craniale, prezente doar pe o parte la cei doi subiecńi menńionańi anterior, corelate cu aspectul dublu al limfonodurilor cervicale profunde caudale. Surprinzător, limfonodurile cervicale superficiale au fost duble la aceste cazuri.

4 Prima stańie limfonodală aparńinând sensului de drenaj caudal a fost reprezentată de limfonodurile inghinale superficiale, triple în două situańii. În continuare, drenajul caudal a cuprins aceleasi limfonoduri ca la loturile prcedente. Lotul V, a avut particular injectarea glandei mamare toracale craniale T1, urmând acelaşi protocol si tehnică a limfografiei indirecte utilizată în prcedentul lot, cu urmărirea sensului de drenaj al acestei glande. Ceea ce am constatat a fost faptul că există două posibilităńi de drenaj cranial, respectiv principal, reprezentat de limfonodurile axilare proprii şi limfonodurile sternale craniale şi secundar, prin limfonodurile cervicale profunde caudale sau direct în limfonodurile cervicale superficiale. În conformitate cu rezultatele obńinute, putem afirma că în sens caudal, glanda mamară toracală cranială nu prezintă vase limfatice ce ar putea deveni aferenńe limfocentrilor inghinali superficiali sau ai celor din cavitatea abdominală, care, deşi au fost identificańi nu au fost impregnańi cu albastru Evans. Lotul VI a avut o altă abordare a cercetărilor, axate pe evidenńierea modelului de vascularizańie limfatică a glandelor mamare, precum şi a conexiunilor între mamelele adiacente şi simetrice. Pentru o cât mai facilă difuzie şi penetrare a substanńei colorante, am utilizat o concentrańie de 0,5%, 0,1ml pe punct injectat, administrată în două puncte, atât în parenchimul mamar cât şi în Ńesutul conjunctiv interstińial al fiecărei glande mamare de studiat, timp de cinci zile consecutiv. Intepretarea rezultatelor s-a realizat la 48 de ore de la ultima administrare. Acest protocol ne-a permis evidenńierea anatomiei şi tipului vascularizatiei limfatice, care se prezintă sub două aspecte: un model reticular şi un model plexiform. Ce trebuie specificat este că pe acelaşi individ, şi fără să existe o corelańie am întâlnit ambele modele vasculare, mamela T2 având o vascularizańie de tip plexiform, iar mamela A1 de tip reticular. Referitor la conexiunile limfatice între glandele mamare, urmărite la subiecńii acestui lot atestăm existenńa conexiunilor fie reticulare, fie plexiforme în majoritatea cazurilor, între glandele mamare T2, A1 şi A2 aspecte vizualizate la injectarea mamelei A1. Luând în considerare cele precizate, am putea emite ipoteza drenajului cranial al glandei mamare A2 şi caudal al glandei mamare T2, dar specificăm că noi nu am remarcat vase limfatice ce ar putea realiza aceste tipuri particulare de drenaj. DiscuŃii. Pe parcursul elaborării acestei lucrări am dat un răspuns cât mai plauzibil elucidării aspectelor luate în studiu, corelând datele proprii cu multiplele sugestii oferite de literatura de specialitate. Astfel, analizând rezultatele obńinute în primul lot al studiului, mergând prin tatonare, începând de la o concentrańie de 10%, urmând concentrańia de 5% la lotul II, 2,5% la lotul III, 1% pentru lotul IV şi V, am ajuns la final la concentrańia de 0,5% la lotul VI. ConcentraŃiile ridicate au permis vizualizarea pregnantă a limfonodurilor în detrimentul vaselor limfatice, aspect ce s-a schimbat pe măsura scăderii valorii ei. Afirmăm, în aceste condińii, că cea mai corespunzătoare valoare a concentrańiei colorantului albastru Evans, pretabilă identificării atât a limfonodurilor cât şi a vaselor limfatice, este cea de 1%, respectiv 0,5%. De asemenea, cantitatea injectată a fost variabilă, precum şi timpul de aşteptare până la citirea rezultatelor. În studiul nostru, cele două componente, şi anume, sistemul vascular limfatic şi limfonodurile, sunt inseparabil tratate. Am urmărit să le includem deopotrivă limfonodurile şi vascularizańia limfatică plecând de la premiza că este nevoie de o interpretare funcńională care să nu se limiteze doar la descrierea morfologică, ci să urmărească aspectele dinamice ale circulańiei limfatice raportate topografiei limfonodurilor. Sistemul circulator limfatic este de fapt un stadiu avansat şi perfecńionat al interstińiului. Modul de aparińie al vaselor limfatice în deget de mănuşă, explicat prin limangiogeneză, precum şi permeabilitatea crescută a acestora, este o facilitate pentru celulele metastatice în a aborda reńeaua limfatică. Ipoteza limfangiogenezei suplimentare în contextul prezenńei unei tumori

5 mamare este susńinută de bogăńia vaselor limfatice peritumorale. Astfel, în studiul nostru am evidenńiat două tipuri ale vascularizańiei limfatice perimamare şi anume: o reńea vasculară de tip plexiform şi o alta de tip reticular, ambele întâlnite la acelaşi subiect şi aparńinând planului superficial subcutanat. Organizarea divergentă sau convergentă a vascularizańiei o considerăm pe de o parte o caracteristică a variabilităńii sistemului limfatic, iar pe de altă parte o încadrăm în riscurile crescute inerente diseminării metastatice. Investigarea şi semnalarea tulburărilor limfodinamice începe de la o bună cunoaştere a traseului limfatic şi este tot atât de importantă ca studiul aspectelor limfonodale, implicańiile sunt multiple şi nu pot fi ignorate. La traseul canalicular bine dirijat al vaselor trebuie inclus şi circuitul limfatic al traseelor nedirijate, al căilor de derivańie evidenńiate în cercetările noastre privind limfocentrul axilar şi inghinofemural. PrezenŃa acestor căi de derivańie, active în special în condińii patologice constituie una din modalităńile de diseminare limfatică şi implicit, localizarea neprevăzută a multor metastaze. În urma cercetărilor noastre referitoare la studiul drenajului limfatic al glandei mamare abdominale craniale A1, am arătat sensul dublu, atât cranial cât şi caudal al drenajului limfatic, respectiv în spre limfonodurile axilare, sternale craniale şi uneori chiar cele cervicale profunde caudale sau cervicale superficiale în sens cranial. În ceea ce priveşte sensul de drenaj limfatic caudal, acesta vizează limfonodurile inghinale superficiale, iliofemurale, iliace mediale şi lomboaortice. Acest nou traseu al drenajului limfei în legătură cu a treia glandă mamară (A1), cuprinzând limfonodurile iliace mediale şi lomboaortice poate explica prezenńa metastazelor mamare la nivelul toracelui, chiar fără implicarea limfonodului axilar şi inghinal superficial, deşi metastazarea la nivelul plămânilor, mai ales în cazul sarcoamelor nu poate fi exclusă. Mai mult, am relevat pentru glanda mamară abdominală cranială (A1) sănătoasă o participare simultană a limfocentrilor axilar şi inghino-femural sau inghinal superficial, cu toate că predominant se pare că ar fi drenajul axilar. Există situańii, în care drenajul limfatic mamar cranial are un alt traiect. Am demonstrat existenńa unor vase limfatice ce ocolesc limfonodurile axilare ajungând fie în cele sternale craniale, de aici în cervicale profunde caudale, sau chiar în cele cervicale superficiale. Nu este exclusă varianta directă, din limfonodurile sternale craniale către conductul limfatic drept ori canalul toracic, în această situańie limfonodul axilar nefiind interesat. Putem anticipa în această situańie că diseminarea metastatică este deosebit de facilă în spre mediastin. Ca o concluzie, referitoare la neoplazia glandei mamare abdominale craniale (A1), diseminarea spre lanńul mamar contralateral este posibilă prin limfocentrul axilar, astfel încât creşte riscul metastazelor sistemice, datorită proximităńii sale de alńi limfocentri, cum ar fi cel cervical superficial şi toracic ventral. Cu privire la glanda mamară toracică cranială (T1) complexitatea drenajului acesteia poate fi explicată folosind date de embriologie, deoarece limfangiogeneza se produce în asociere cu cea a sistemului venos, iar acest proces este mult mai dezvoltat la intrarea în torace, la animalele domestice. Oricum, glanda mamară A1, prezintă un drenaj mult mai complex pentru o femelă sănătoasă, datorită pozińiei ei centrale în rândul glandelor mamare. Limfocentrul care prezintă o deosebită importanńă, este limfocentrul axilar. În studiul nostru, limfonodul axilar propriu este prezent la tońi subiecńii, cu menńiunea că limfonodurile axilare accesorii sunt prezente la 68% din cazuri. Analizând drenajul cranial al glandelor mamare T1, T2, şi A1 am remarcat absenńa limfonodului axilar accesoriu la unele exemplare şi am demonstrat prezenńa unor limfonoduri suplimentare al limfocentrului axilar, aspect neântâlnit în datele din literatura de specialitate consultate de noi. Acestui fapt îi atribuim două explicańii. Prima ar putea fi legată de acelaşi necesar de filtru limfatic în condińiile în care dimensiunile limfonodurilor proprii şi accesorii au fost mai mici comparativ cu alte cazuri, având în vedere teritoriul destul de întins pe care îl

6 deserveşte limfocentrul axilar, iar a doua o putem încadra în marea variabilitate a sistemului limfatic la specia canină. La două cazuri din cele studiate, limfonodul axilar propriu, s-a prezentat ca fiind alcătuit din două formańiuni ovalare unite într-o capsulă comună. Continuând sensul de drenaj cranial, următoarele limfonoduri evidenńiate la tońi subiecńii au fost cele sternale craniale, stângi şi drepte, aparńinând limfocentrului toracic ventral. Cele stângi au fost remarcate în majoritatea cazurilor (94%), din care, la un caz am remarcat componenńa dublă a limfonodului sternal cranial stâng în condińiile absenńei celui drept. SituaŃia inversă am semnalat-o la un alt caz al aceluiaşi lot, adică prezenńa limfonodului sternal cranial drept dublu în absenńa limfonodului sternal cranial drept Limfonodurile cervicale profunde caudale, aparńinând limfocentrului cervical profund, leam identificat la 15 subiecńi (68% din cazuri), sesizând şi aici în două cazuri aspectul dublu al acestora. Ultima stańie limfonodală implicată în drenajul glandelor mamare, este limfonodul cervical superficial, prezent la tońi subiecńii studiului nostru. De asemenea, limfocentrul inghinofemural, mai specific, limfonodul inghinal superficial a fost impregnat cu substanńă colorantă foarte bine. Acesta a fost prezent la 100% din subiecńi, având o componenńă variabilă: simplă, dublă (42% din cazuri) sau chiar triplă (10% din cazuri). De asemenea, la 6 subiecńi din cei studiańi am sesizat prezenńa vaselor limfatice ce traversează planul median, făcând legătura între cele două limfonoduri inghinale superficiale simetrice. In sensul drenajului caudal, următoarele stańii limfatice sesizate au fost limfonodurile iliofemurale prezente la 10 cazuri (52% din total) bine colorate, fiind în proximitatea primului limfonod impregnat cu colorantul injectat în parenchimul glandei mamare. Limfonodurile iliace mediale au fost semnalate în toate cazurile, în plus am identificat un limfonod suplimentar, intermediar ca mărime între limfondurile iliofemurale şi cele iliace mediale care au fost constant întâlnite. Limfonodurile sacrale şi lomboaortice, au fost remarcate la toate căńelele, ca prezenńă topografică şi morfologie, dar acestea s-au vizualizat mai greu, în urma slabei colorări datorată distanńei relativ mai mari de locul de injectare al colorantului. Referitor la limocentrul popliteu menńionăm că l-am identificat la tońi subiecńii, mai mult datorită dispunerii sale superficiale, decât impregnării cu albastru Evans, iar la doi subiecńi am remarcat componenńa dublă şi chiar triplă la un alt subiect. În concluzie, analizând rezultatele obńinute la explorarea limfografică indirectă, afirmăm că în vederea evidenńierii sistemului limfatic mamar, injectarea substanńei colorante albastru Evans a permis cea mai bună evidenńiere a vaselor limfatice reuşind să le urmărim până la intrarea în limfonodul santinelă. Totodată am evidenńiat şi Ńesutul mamar, mai ales în ceea ce priveşte reńeaua limfatică. Am arătat că o parte din vasele limfatice nu trec prin cunoscutul limfonod santinelă (primul limfonod eferent glandei mamare luate în studiu), aspect care nu respectă norma comună, explicând în acest fel aparińia metastazelor la distanńă sau profunde tocmai datorită existenńei acestor vase limfatice ocolitoare. Ultrasonografia. O altă metodă utilizată în cercetările noastre a fost ultrasonografia aplicată în vederea îndeplinirii următoarelor obiective : evidenńierea anatomiei topografice ecografice a limfonodurilor superficiale pretabile acestei metode de explorare ; precizarea datelor morfologice legate de dimensiune, formă, contur şi structură ecografică, a limfocentrilor axilari, limfonodurilor inghinale superficiale şi al limfocentrului popliteu. Ecografia, pe lângă descrierea aspectelor limfonodurilor are avantajul că nu pierde din vedere evaluarea structurilor adiacente şi încadrarea într-un tablou fiziologic sau patologic.

7 Explorarea ecografică a limfonodurilor superficiale, fundamentate pe cercetările limfografice anterioare, aduce o contribuńie în plus la descrierea aspectelor morfologice normale ale acestora. De asemenea, pe lângă ecografia bidimensională a detaliilor structurale, am evidenńiat tipul vascularizańiei limfonodurilor utilizând tehnicile ecografice Doppler color şi power Doppler. Pe baza acestor metode, semiologia ecografică normală are rolul de a fixa criteriile de la care se porneşte în explorarea formańiunilor patologice. Examinarea ecografică determină pe de o parte, dacă într-un context de tumoră mamară există reacńie limfonodală superficială, iar pe de altă parte indică sediul limfonodului santinelă contribuind astfel la departajarea criteriilor de diferenńiere ale adenopatiilor benigne de cele maligne. Cercetările noastre în vederea identificării primei stańii limfonodale care drenează un teritoriu mamar au fost posibile prin injectarea de agent de contrast ecografic cu tropism pentru sistemul monocitomacrofagic, urmată de explorarea ecografică utilizând tehnica armonicilor superioare. Aceste aspecte, le-am demonstrat la injectarea agentului de contrast Levovist în parenchimul mamar al glandei abdominale caudale, reuşind încă odată să atestăm prezenńa unor vase limfatice ce trec linia albă. În cazul tumorilor, această identificare, a limfonodului santinelă de fapt, este posibilă prin administrarea peritumorală a contrastului urmată de examinarea ecografică, care relevă aparińia unor modificări ale ecogenităńii limfonodale. Examinarea Doppler semnalează un număr mult mai mare de vase sanguine şi cu dispozińie dezordonată, periferică, caracteristică în cazul limfonodurilor metastatice. Limfografia directă. Cu toate că limfografia nu se limitează doar la examenul imaginilor limfonodale, există situańii în care abordul unui vas limfatic în vederea examinării limfografice directe este practic imposibilă. Precizăm doar câteva situańii şi anume: cazurile de limfedem, posibilitatea existenńei unor blocaje limfatice, sau caracterul fragil al reńelei vasculare limfatice. Extrapolând această tehnică şi bazându-ne pe potenńialul de abord clinic al unor limfonoduri am fost interesańi şi de alte metode de evidenńiere a limfonodurilor. Obiectivele studiului limfografic direct, adaptat cecetărilor noastre, au vizat următoarele aspecte: aprecierea oportunităńii administrării direct intralimfonodale a substanńelor de contrast radioopace; stabilirea limitelor explorării Ńinând cont de particularităńile anatomofiziologice ale sistemului limfatic în general şi în particular ale limfonodurilor superficiale la specia canină; evaluarea comparativă a informańiilor obńinute; analiza cu discernământ a raportului beneficiu/risc. La urmărirea radiologică a aspectelor limfonodale la administrarea directă a substanńei de contrast hidrosolubile, Ultravist 300, (în limfonodul popliteu în cazul nostru), am reliefat aspecte importante ale caracteristicilor limfonodale elementare prin opacifierea limfonodului popliteu. Însemnătatea expunerii caracterelor normale rezidă din importanńa depistării adenopatiilor şi motivează atenńia acordată în studiul nostru structurii limfografice a limfonodurilor. Anomaliile de opacifiere sunt, după părerea noastră, cele mai importante criterii în enunńarea unui diagnostic limfadenografic. Dispunerea lacunelor, centrală sau periferică este un criteriu de diferenńiere al afecńiunilor limfonodale. Cu toate acestea, pe lângă avantajul analizei in vivo a structurii macroscopice a limfonodurilor opacifiate, şi o inserńie biologică fără riscuri, dezavantajul administrării directe intralimfonodale a substanńelor radioopace hidrosolubile de tipul Ultravist 300, este legat de timpul de remanenńă scurt al acestor substanńe. Acest fapt nu permite o apreciere exactă şi în totalitate a tuturor criteriilor urmărite.

8 În rezumat, putem afirma necesitatea şi importanńa cunoaşterii aspectelor limfonodale cât şi a celor vasculocirculatorii normale, interpretarea imagistică ultrasonografică şi radiologică oferind informańii deosebit de preńioase, asupra unui vast teritoriu limfatic, în afecńiuni la care participarea limfatică se situează pe primul plan. Rezultatele obńinute în studiul nostru, ne-au permis extragerea mai multor concluzii. 1. Colorantul albastru Evans, folosit în studiile noastre, a vizualizat vasele limfatice ale glandelor mamare, precum şi limfonodurile adiacenńi acestora, într-un mod destul de evident la o concentrańie şi respectiv o cantitate mică (0,5% - 1%, respectiv, 0,2 0,4 ml). 2. Referitor la glanda mamară abdominală cranială (A1), am arătat că are pe lângă un drenaj limfatic constant, dublu, homolateral, atât în sens cranial cât şi în cel caudal, şi un drenaj limfatic ocazional heterolateral caudal. 3. În ceea ce priveşte drenajul limfatic caudal al glandei mamare abdominale craniale (A1), am demonstrat că pe lângă limfonodurile inghinofemurale sau inghinale superficiale, cuprinde şi limfonodurile iliofemurale (atunci când sunt prezente), precum şi cele iliace mediale, sacrale şi chiar lomboaortice. 4. În urma acestui studiu, am relevat că glanda mamară abdominală cranială (A1) are drenajul limfatic cranial majoritar în spre limfocentrul axilar şi cel toracic ventral, iar întâmplător şi de limfonodurile cervicale profunde caudale. 5. Rezultatele noastre demonstrează că există conexiuni limfatice între cele trei glande învecinate: T2, A1 şi A2, legătură ce a putut fi observată când am injectat glanda A1, iar în privinńa tipului de conexiune, se pare că acesta diferă atât de la individ la individ, cât şi de la o glandă mamară la alta. 6. Tot în studiul nostru, am dovedit că glanda mamară toracică cranială (T1) are drenajul limfatic cranial majoritar de către limfocentrul axilar şi cel toracic ventral, iar minoritar şi de limfonodurile cervicale profunde caudale, şi cele cervicale superficiale, cu precădere pachetul limfonodal ventral. 7. Mai mult am demonstrat existenńa de vase limfatice care traversează planul median (linia albă), şi care fac legătura între cele două grupări limfonodale inghinale superficiale, aspect care nu a fost confirmat de alńi autori. 8. Rezultatele noastre semnalează marea variabilitate morfologică a sistemului limfatic, în sensul prezenńei sau absenńei anumitor limfonoduri în funcńie de individ, precum şi existenńa anumitor vase limfatice aferente care ocolesc primele limfonoduri superficiale şi ajung în următoarele situate mai în profunzime, explicând astfel aparińia metastazelor la distanńă. 9. Prin metoda ecografică am furnizat date morfologice şi funcńionale, dinamice şi exacte obńinute în timp real referitor la topografia, componenńa, forma şi structura limfocentrilor axilari, inghinali superficiali şi poplitei, cei mai pretabili de altfel şi explorării clinice prin metoda semiologică palpatorie la această specie. 10. Cu ajutorul agentului de contrast ecografic, am evidenńiat drenajul glandei mamare A2, către limfonodurile inghinale superficiale, semnalând totodată avantajul acestei metode imagistice prin faptul că permite o examinare rapidă, neinvazivă, directă şi lipsită de nocivitate. 11. Am expus cu ajutorul imagisticii pe lângă vasele limfatice, şi caracteristici ale circulańiei limfonodale axilare şi inghinale superficiale, folosind metodele Doppler color şi power Doppler, astfel încât în condińii patologice poate oferi succesiv examenului clinic, aspecte legate de natura inflamatorie sau neoplazică a leziunii limfonodale. 12. Folosind metoda radiologică şi injectarea substanńei de contrast hidrosolubile Ultravist, direct intralimfonodal am relevat aspecte topografice, morfologice şi structurale ale limfonodului popliteu, recomandând această cale de administrare doar în situańia prezenńei blocajelor vasculare limfatice. ObservaŃii şi recomandări:

9 Pe baza studiului nostru recomandăm utilizarea metodelor de imagistică medicală utilizate de noi, cu sau fără agenńi de contrast, ca etapă prioritară în evaluarea animalelor suspecte sau afectate de neoplazii prin faptul că au avantajul specificităńii, inofensivităńii şi sunt puńin costisitoare. Totodată, mai prezintă avantajul că de multe ori se poate suplini efectuarea unor biopsii limfonodale nejustificate. O altă recomandare ar fi ca în cazul neoplasmelor mamare, să se efectueze pe lângă ablańia glandei mamare afectate sau a întregului lanń mamar şi a limfonodurilor santinelă. PrezenŃa limfonodurilor suplimentare, cât şi a vaselor care ocolesc limfonodurile santinelă, accesând direct limfonodurile viscerale, explică unele particularităńi privind metastazarea tumorilor. ConsideraŃii sau aprecieri generale. Sistemul limfatic, acest domeniu insuficient explorat încă, se prezintă ca fiind acelaşi la majoritatea speciilor în ceea ce priveşte ontogeneza, rolul şi funcńiile sale. Ceea ce-l deosebeşte la specia canină este fluctuańia sa. Marea variabilitate a sistemului limfatic al speciei canine, şi în special al teritoriului glandei mamare a fost demonstrată în cercetările noastre şi constă în: 1. prezenńa sau absenńa unor limfonoduri aparńinând aceluiaşi limfocentru, fără o corelańie referitoare la simetria acestora pe acelaşi individ, cu implicańii directe în ceea ce priveşte dimensiunea, şi în mod sigur şi rolul; 2. confirmarea aparińiei unor limfonoduri suplimentare, încadrate în limitele fiziologicului, aparńinând limfocentrilor axilari şi ilosacrali; 3. demonstrarea sensului dublu de drenaj, atât cranial, cât şi caudal al glandei mamare abdominale craniale A1 şi stabilirea tipului de conexiune între glandela mamare T2, A1 şi A2; 4. identificarea posibilelor trasee ocolitoare a primei stańii limfonodale tributare unui anumit teritoriu; 5. certificarea existenńei unor vase limfatice ce trec linia mediană făcând legătura între unele glande mamare simetrice, chiar între unele limfonoduri la câteva cazuri studiate; 6. atestarea prezenńei pe acelaşi subiect a modelului vascular plexiform şi reticular al reńelei limfatice a glandelor mamare, neexistând o corelańie între glandele mamare simetrice sau adiacente. Ca o consecinńă directă a celor menńionate anterior, se poate accepta rolul primordial al limfografiei indirecte ca metodă principală a cercetărilor noastre în vederea îndeplinirii obiectivelor propuse, deoarece considerăm că aceasta a adus şi va aduce şi în viitor elemente de anatomie, fiziologie şi fiziopatologie, deosebit de importante, ale sistemului limfatic.

10 Summary SUMMARY OF DOCTORAL THESIS Studies on the lymphatic system in general, and on the mammary gland in canines in particular, represent major challenges given the complex diversity of this system and the small amount of research carried out in this vast area. This paper is an integrated and at the same time multilateral approach to the specific features of the lymphatic system in canines. This approach fully correlates with the modern investigation methods now available. Current issues are tackled in order to supply the lack of information regarding the interpretation of morphological, physiological and therefore pathological features noted in the literature. The objective of the current thesis was to highlight the lymphatic system of mammary glands in female dogs. Indirect lymphography with intravital contrast agents was the main method used. Ultrasonography and direct lymphography were also employed. The doctoral thesis has 212 pages divided into 12 chapters. The first chapters include a complex study based on data collected from 343 literature sources. The following chapters feature our original research contributions to the study of the lymphatic system of the mammary gland in canines. Thus, the first chapter contains a brief history of lymphatic system investigations, scientifically outlined during observations on animals. We particularly presented a few aspects related to the topographic interpretation and classification used in the past. The second chapter contains data on the morphology of the lymphatic system, from ontogenetic development to the morphology of lymph nodes and lymph vessels. Special focus was placed on lymph node topography in order to understand the details of the common norm attributed to the canine species. The chapter on the ontogeny, morphology and physiology of the mammary gland tackles aspects concerning its structure as well as vascularization and innervation. Special attention is given to the role of the lymphatic system in tumor pathology as chapter five focuses on tumor lymphangiogenesis and spread of metastases. The following chapter investigates bibliographic data on the main study methods of the lymphatic system in order to find the most suitable research method. Consequently, indirect lymphography was selected as the main research technique. The original research contribution is 130 pages long and includes the objectives, material and methods, results, discussion and general conclusions of the study. The material included a group of 24 female dogs, divided into three screenings: 19 female dogs of the same breed, of various ages and weight, underwent indirect lymphography while 5 dogs were investigated with imaging methods: 3 with ultrasonography and 2 with direct lymphography. The above-mentioned methods were adapted to meet the aim of our research. Indirect lymphogaphy Indirect lymphography is used to highlight lymphatic vessels and their associated lymph nodes by administering dying or contrast agents into interstitial connective tissue. Surgery on the lymphatic vessels is thus avoided. The following objectives were set in order to meet the aim of the study: to comparatively define and assess the pattern of lymphatic vascularization of mammary glands; to show the connections between adjacent and/or symmetrical mammary glands, correlated with the connection pattern between symmetrical lymph nodes; to analyze cranial and/or caudal lymphatic drainage of the mammary glands; to indicate lymph node stations according to the direction of lymphatic drainage.

11 Summary Therefore, we injected dying agents both subcutaneously and in the mammary parenchyma in order to highlight the entire lymphatic network as well as to observe the direction of lymphatic drainage and the corresponding lymph node stations. The dying agent used was Evans blue, which is very soluble, easily penetrable and has marked tropism for lymphatic tissue. In the absence of a standard administration protocol, we designed our own injection scheme, in terms of both the concentration and quantity of Evans blue dye used and the waiting time needed before interpreting the results. Consequently, indirect lymphography was the main study technique used in 19 female dogs divided into 6 groups. Thus, in group I, 2 ml and 0.5 ml of 10% Evans blue dye were injected subcutaneously and into the parenchyma of the right A1 cranial abdominal mammary gland, respectively. After a 24-hour waiting time, we noticed that the injected mammary area was strongly impregnated with Evans dye. Under such conditions, the mammary lymphatic network could not be identified; however, the lymphatic centers corresponding to cranial and caudal drainage were clearly observed. Therefore, in cranial direction, the axillary lymph nodes and the accessory lymph nodes belonging to the axillary lymphatic center as well as the left cranial sternal lymph nodes belonging to the ventral thoracic lymphatic center situated opposite to the injection site were well outlined as the dye reached the right caudal deep cervical lymph nodes. In caudal direction, the right superficial inguinal and right iliofemoral lymph nodes as well as the lymph nodes of the iliosacral lymphatic center (medial iliac and sacral) were clearly noticed. The lumbar aortic lymph nodes were also visualized. Group II included five female dogs that were injected in the left A1 cranial abdominal mammary gland with 5% concentration dye. However, the administration and reading protocol differed. The same protocol as in group 1 was applied in two cases in terms of quantity and interpretation while three animals were injected with 0.8 ml per total mammary gland, 0.2 ml per injection site. The results were read at 48 hours. Compared with the previous group, the studied mammary gland drained both cranially and caudally. The first lymph node station drained cranially into the lymph nodes and axillary lymph nodes from the injected side in two subjects while only axillary lymph nodes were identified in other three subjects. By following the direction of caudal drainage, we noted that cranial sternal lymph nodes were only colored on the left side in most cases, while both the left and right cranial sternal lymph nodes were noted in one case. The deep caudal cervical lymph nodes were present in four cases and absent in the one case with both left and right cranial sternal lymph nodes. We only recorded the presence of superficial cervical lymph nodes and not their coloring. Caudal drainage was represented by the inguinofemoral or superficial inguinal lymph center, particularly in the left superficial inguinal lymph nodes in three subjects. It is worth mentioning that a lighter shade of Evans blue dye was observed in the superficial inguinal lymph nodes situated opposite to the injection side (right) in other two subjects in this group. The iliofemoral lymph nodes were impregnated with Evans blue dye in only one subject. On the other hand, we noticed strong coloring of the medial iliac lymph nodes on the injected side while the symmetrical lymph nodes were not macroscopically impregnated. One subject presented an extra medial iliac lymph node while an extra sacral lymph node was identified in another subject. Various number and size lumbar aortic lymph nodes were slightly colored in all cases. The popliteal lymph node was always present although its lymph nodes could not be macroscopically determined. In this group, one subject had two and another one three popliteal lymph nodes. Group III included 5 subjects. Indirect lymphograhy with 2.5% concentration and 0.4 ml (0.1 ml on injected point) dying agent was carried out in order to highlight cranial and caudal drainage of the A1 mamma. The characteristic features of lymph nodes in the drainage direction and the corresponding lymphatic vessels were also viewed. The results were read at 24, 48 and 72 hours. Thus, we again established that the cranial abdominal mammary gland first drained cranially into the axillary lymph center. Moreover, we observed a lighter coloring of the axillary

12 Summary lymph center opposite to the injection side in one case. Most cases presented both axillary lymph nodes (accessory nodes included). In this group, cranial drainage also included the cranial sternal lymph nodes (present on only one side in three subjects) and the caudal deep lymph nodes (in two subjects) while the superficial cervical lymph nodes were present in all subjects. Caudal drainage included the superficial inguinal lymph nodes, which were double and colored on the injection side as well as on both sides in two subjects. We again confirmed the presence of lymphatic vessels beyond the median plane. We also noted the presence of vessels that avoided the superficial inguinal lymph nodes and were headed towards the iliofemoral or medial iliac lymph nodes. These were more diffusely colored on the opposite side of injection. The sacral lymph nodes were also less colored since only some of the afferences reached here while most of them went from the superficial inguinal or iliofemoral lymph nodes towards the medial iliac lymph nodes. We observed the presence of one extra lymph node belonging to the medial iliac and even sacral lymph nodes. The lumbar aortic lymph nodes were well impregnated with Evans blue dye, which confirms that they may receive afferences from the medial iliac or iliofemoral lymph nodes as well as direct afferences from the superficial inguinal lymph nodes. Group IV was also injected in the A1 cranial abdominal mammary gland with the same quantity as in the previous group; however a 1% concentration was injected for five consecutive days and the results read at 48 hours following the last injection. In this context, we first aimed to analyze the vascular pattern of the mammary gland studied. Although serial injections were administered and the waiting time was relatively sufficient, we assessed lymphatic vascularization with difficulty since the mammary parenchyma was intensely colored in the center and less so towards the periphery. However, a central plexiform and perimammary reticular vascularization was noted. Further studies are required in order to clarify the above-mentioned aspects. The A1 mamma drained cranially into the axillary lymph center in most cases. The presence of one extra lymph node belonging to the axillary lymph center, which had not been previously reported in our research, is a particular feature of this group. Two subjects also presented two axillary lymph nodes. Therefore, there were two cranial sternal lymph nodes, present on only one side in the two previously-mentioned subjects, once again correlated with the two caudal deep cervical lymph nodes. Surprisingly, these cases also presented two superficial cervical lymph nodes. The superficial inguinal lymph nodes, triple in two subjects, were the first lymph node station in the caudal drainage direction. Next, caudal drainage included the same lymph nodes as in the previous groups. Group V was injected in the T1 cranial thoracic mammary gland. Indirect lymphogaphy and the same protocol were used. The drainage direction of this gland was observed. We noted that there were two cranial drainage possibilities: the axillary lymph nodes and the cranial sternal lymph nodes, followed by the caudal deep cervical lymph nodes or the superficial cervical lymph nodes. According to our results, we may state that caudally, the cranial thoracic mammary gland did not present lymphatic vessels that could become afferences of the superficial inguinal or abdominal lymph centers, which were identified despite the fact that they were not impregnated with Evans blue dye. Group VI underwent a different approach. The focus was on highlighting the pattern of lymphatic vascularization of the mammary glands as well as the connections between the adjacent and the symmetrical mammae. In order for the dying agent to spread and penetrate easier we administered a concentration of 0.5%, 0.1 ml on injected point, both in the mammary parenchyma and in the interstitial connective tissue of each studied mammary gland for five consecutive days. The results were read at 48 hours after the last injection. This protocol allowed us to observe the anatomy and the two lymphatic vascularization types: a reticular pattern and a plexiform one. Both vascular patterns were observed in the same subject whose T 2 mamma presented plexiform vascularization while the A1 mamma showed reticular vascularization.

13 Summary We proved the presence of mostly reticular or plexiform connections among the T2, A1 and A2 mammary glands in this group of subjects. These connections were noted on injection of the A1 mamma. Therefore, based on our observations we hypothesized that the A1 mammary gland drained cranially while the T2 mammary gland drained caudally. However, we did not identify any lymphatic vessels able to perform such drainage. Discussions This thesis provided plausible answers to the studied issues by correlating our data with the numerous suggestions offered in the literature. Thus, results analysis showed that we changed the concentration from the initial 10% used in group I to 5% in group II, 2.5% in group III, 1% in groups IV and V and finally 0.5% in group VI. The high concentrations enabled us to clearly visualize lymph nodes at the expense of lymphatic vessels. This aspect changed as lower concentrations were used. Therefore, the 0.5% Evans blue dye proved to be most suitable for identifying lymph nodes and lymphatic vessels. The quantity injected and the waiting time prior to reading the results varied. In our research, the lymphatic vascular system and lymph nodes were both studied. We included lymph nodes as well as the lymphatic vascularization on the premise that a functional interpretation of the dynamic aspects of lymphatic circulation, taking into consideration lymph node topography, is required instead of a mere morphological description. The lymphatic circulatory system is actually an advanced, improved stage of the interstitium. The occurrence of lymphatic vessels in glove finger, explained by lymphangiogenesis, and their increased permeability allow metastatic cells to enter the lymphatic network. The hypothesis of supplementary lymphangiogenesis in the presence of a mammary tumor is supported by the rich peritumoral lymphatic vessels. Thus, we highlighted two types of perimammary lymphatic vascularization: a plexiform vascular network and a reticular one, both present in the same subject in the superficial subcutaneous plane. On the one hand, the divergent or convergent vascularization is a feature of system instability while on the other hand it increases the risk of metastatic spread. The study of lymphodynamic disorders, which requires good understanding of the lymphatic route, is as important as the study of lymph nodes given the numerous implications that cannot be ignored. The well guided canalicular route of vessels must also include the lymphatic network of unguided routes and the derivation pathways of axillary and inguinofemoral lymph centers highlighted in our study. The presence of such derivation patterns, active especially under pathological conditions, signals lymphatic spread and implicitly the unpredictable localization of many metastases. Our research indicated that the A1 cranial abdominal mammary gland drained both cranially and caudally into the axillary, cranial sternal and sometimes caudal deep cervical or superficial cervical lymph nodes. The caudal lymphatic drainage covered the superficial inguinal, iliofemoral, medial iliac and lumbar aortic lymph nodes. This new route of lymphatic drainage in the third mammary gland (A1), which included the medial iliac and lumbar aortic lymph nodes, may explain the occurrence of mammary metastases in the thorax even without the involvement of the axillary and superficial inguinal lymph nodes. However, lung metastases, especially in sarcoma cases, should not be excluded. Furthermore, we revealed that the healthy cranial abdominal mammary gland (A1) drained simultaneously into the axillary and inguinofemural or superficial inguinal lymph nodes, although axillary drainage seemed to prevail. However, in some situations the cranial mammary lymphatic drainage had a different route. We demonstrated the presence of lymphatic vessels that avoided the axillary lymph nodes and reached either the cranial sternal lymph nodes and then the cranial mediastinal or caudal deep cervical nodes, or the superficial cervical lymph nodes. The direct route is also possible: from the