Biochimie - Curs Introducere Biochimia este literalmente o disciplină care studiază chimia vieții. Cu toate că se suprapune cu alte discipline

Transcriere

1 Introducere Biochimia este literalmente o disciplină care studiază chimia vieții. Cu toate că se suprapune cu alte discipline (Biologia celulară, Genetică, Imunologie, Microbiologie, Farmacologie, Fiziologie), Biochimia are în vizor un număr limitat de întrebări: o Care sunt structurile chimice și tridimensionale ale moleculelor biologice? o Cum interacționează moleculele biologice? o Cum sunt sintetizate și degradate moleculele în organismele vii? o Cum este conservată energia și utilizată de celulă? o Care sunt mecanismele de organizare a moleculelor biologice și de coordonare a activității lor? o Cum este stocată, transmisă și folosită informația genetică în scopul biosintetizei unui produs funcţional (proteină sau ARN)? Biochimia este importantă și în alte domenii științifice. Astfel, se poate studia un aliment din punct de vedere al conținutului compușilor biochimici (vitamine, aminoacizi, acizi grași) sau diverselor minerale, fiecare dintre aceștia având un rol esențial pentru o nutriție adecvată. Biochimia explică cum acești nutrienți sunt absorbiți de către organism și care este rolul acestora în celulă. De exemplu, la întrebarea: cum preia organismul energia din grăsimile sau uleiurile (din dietă)? procesul poate fi explicat printr-o serie de reacții biochimice care intervin în căile metabolice (calea metabolică - succesiune de reacții biochimice). În citozol (faza apoasă a celulei) există o colecție de molecule organice (cu mase moleculare de de unități atomice de masă) numiți metaboliți centrali în căile metabolice primare. Această colecție de molecule include aminoacizii comuni, nucleotidele, zaharurile și derivații fosforilați ai acestora și un număr de acizi mono-, di- sau tricarboxilici. Aceste molecule sunt polare sau încărcate, solubile în apă și prezente în concentrații de ordinul µm sau mm. Acești compuși sunt prizonieri celulari deoarece membrana plasmatică este semipermeabilă. Există în schimb proteine specializate ce pot transporta acești compuși în celulă sau înafara acesteia sau între două compartimente celulare diferite. Mai mult, în interiorul celulei sunt prezente și alte molecule mici, specifice pentru un anumit timp de celulă sau organism. De exemplu, plantele vasculare conțin și metaboliți secundari, care joacă un rol important în dezvoltarea plantei. Acești compuși se disting prin aromele caracteristice sau prin efectele fiziologice

2 pe care le manifestă asupra organismului uman (morfina, chinina, nicotina sau cafeina). Toată colecția de molecule mici dintr-o celulă poartă numele de metabolom. Energia Producerea, stocarea şi utilizarea energiei sunt aspect importante în economia celulei. Aceste procese sunt guvernate de tăria legăturilor chimice şi determină atât direcţia cât şi viteza reacţiei chimice respective. Celulele necesită energie pentru o multitudine de procese, incluzând sinteza glucozei din CO 2 şi apă din cadrul fotosintezei, contracţia musculară şi replicarea ADN-ului. Energia de interes în studiul sistemelor biologice sau chimice este energia potenţială sau energia stocată. Energia potenţială a atomilor sau moleculelor conferă acestora abilitatea de a suferi reacţii chimice în care se eliberează energie. De exemplu, molecula de glucoză are o energie potenţială ridicată. Energia necesară pentru desfăşurarea unor procese celulare provine în principal din energia eliberată la ruperea unor legături chimice. Toate formele de energie sunt interconvertibile în conformitate cu principiul I al termodinamicii care menţionează faptul că energia nu este creată şi nici distrusă. De exemplu, în procesul de fotosinteză, energia radiaţiei luminoase este transformată în energie chimică potenţială, energie stocată sub formă de legături chimice dintre atomii moleculei de glucoză. În muşchi şi nervi, energia chimică potenţială este transformată în energie mecanică şi cinetică. Deoarece toate formele de energie sunt interconvertibile, acestea pot fi exprimate folosind aceleaşi unităţi de măsură - caloria sau Kilocaloria. Legăturile chimice Există două tipuri de legături chimice: puternice (covalente) sau slabe (necovalente). Legăturile covalente sunt predominante în compuşii organici şi au loc între atomii individuali dintr-o moleculă. Legăturile necovalente dictează arhitectura tridimensională a moleculelor biologice mai mari sau a unor complecşi prin cooperativitate (deşi niciuna dintre legături nu este puternică, efectul mai multor legături necovalente simultane poate fi considerabil). De asemenea, legăturile necovalente pot fi desfăcute mult mai uşor fapt care le permite să stea la baza unor procese dinamice guvernate de reacţii la echilibru.

3 Legăturile covalente sunt foarte stabile; energia necesară ruperii unei legături covalente este mai mare decât energia termică disponibilă la temperatura corpului (25/37 C). Modificările chimice au loc datorită faptului că energia necesară ruperii legăturilor este furnizată prin formarea unor legături noi. De regulă, diferenţele de energie dintre reactanţi şi produşi variază între 1 şi 20 Kcal/mol. În decursul unei reacţii moleculele adoptă stări energetice temporare (care posedă energie mult mai mare) iar energia necesară pentru a obţine aceste stări, care poate atinge chiar şi valori de 100 Kcal/Mol, constituie un parametru al stabilităţii chimice. Acest imbold energetic poartă numele de energie de activare. Sistemele biochimice acţionează specific pentru a învinge energiile de activare, direcţionând preferenţial reacţiile chimice. În situaţia în care doi sau mai mulţi atomi formează legături covalente cu un atom central, aceste legături formează unghiuri (dintre două legături) a căror orientare (valoare) este bine definită. Mai mult, atomii implicaţi în formarea unei legături duble nu se pot roti liber în jurul axei legăturii. Rigiditatea planarităţii impusă de legăturile duble este un parametru esenţial care joacă un rol definitoriu în stabilirea conformaţiei moleculelor biologice cu mase moleculare mari (proteine şi acizi nucleici). În plus, energia the formare a legăturilor duble sau triple din diverse molecule este mai ridicată comparativ cu energia de formare a unei legaturi simple (Tabelul 1). Tabel 1. Valorile energiilor de formare a legăturilor frecvent întâlnite în compușii biochimici Legătura covalentă Energia (Kcal/Mol) Legătura covalentă Energia (Kcal/Mol) C C 213 C O 86 C=O 174 C C 83 C=C 146 C Cl 81 C F 103 S H 81 O H 111 C N 73 C H 99 C S 62 N H 93 O O 35

4 Cele mai frecvent întâlnite legături duble care se regăsesc în moleculele biologice sunt: C=C, C=N, C=O şi P=O. O serie de grupări funcţionale sau conexiuni intramoleculare sunt frecvent întâlnite în biomolecule (Figura 1). Figura 1. Grupări care se pot întâlni frecvent în biomolecule În celulă se disting patru clase principale de biomolecule mici: aminoacizii, carbohidraţii, nucleotidele şi lipidele. Aceste biomolecule pot forma lanţuri macromoleculare mai mari (polimeri) sau pot interacţiona prin intermediul unor forţe slabe situaţie în care pot rezulta suprastructuri moleculare cu importanţă fiziologică (lipidele în membranele biologice). Dipolii În legăturile covalente una sau mai multe perechi de electroni sunt împărţite de către doi atomi. În anumite situaţii, atomii parteneri exercită atracţii diferite pentru electronii de legătură, rezultând astfel o distribuţie inegală a electronilor. Capacitatea de atracţie a atomului pentru electroni poartă numele de electronegativitate. Într-o legătură covalentă în care atomii sunt identici sau diferiţi

5 dar posedă aceeaşi electronegativitate; electronii de legătură sunt distribuiţi în mod egal. O asemenea legătură se numeşte nepolară. În situaţia în care electronegativitatea atomilor implicaţi este diferită, unul dintre aceştia va exercita o forţă de atracţie mai mare asupra electronilor de legătură. O legătură de acest tip se numeşte dipolară; un capăt este parţial încărcat negativ (δ - ) iar celălalt capăt este parţial încărcat pozitiv (δ + ). De exemplu, în molecula de apă atomul de oxigen, cu electronegativitatea 3,5, atrage electronii de legătură mai mult decât atomii de hidrogen (cu electronegativitatea 2,1); cu alte cuvinte, electronii de legătură petrec mai mult timp pe orbita atomului de oxigen decât pe orbita atomilor de hidrogen. Dat fiind faptul că ambii atomi de hidrogen sunt de aceeaşi parte a atomului de oxigen, această parte a molecule are un caracter parţial pozitiv, pe când cealaltă parte are o sarcină parţial negativă. O moleculă care încorporează separate sarcini pozitive şi negative se numeşte dipolară. Legăturile necovalente stabilizează structurile macromoleculelor Multe legături care menţin structurile moleculelor mari, cum ar fi proteinele şi acizii nucleici, nu sunt covalente. Forţele care stabilizează structura tridimensională a moleculelor mari individuale şi care stau la baza interacţiilor dintre molecule sunt adesea mai slabe. Energia eliberată la formarea acestor legături necovalente este de numai 1-5 Kcal/Mol. Deoarece energia cinetică medie a moleculelor la temperatura camerei este de aproximativ 0,6 Kcal/Mol, multe molecule posedă suficientă energie pentru a desface aceste legături slabe la temperaturi fiziologice (25-37 C). Legăturile slabe au o existenţă tranzitorie, dar multe acţionează simultan cu scopul de a da naştere la structuri stabile. Principalele tipuri de legături necovalente sunt: legăturile de hidrogen, legăturile ionice, interacţiunile de tip van der Waals şi interacţiunile hidrofobe. Legătura de hidrogen În mod normal, un atom de hidrogen formează o legătură covalentă cu un alt atom. Mai mult, un atom de hidrogen legat covalent poate forma o legătură suplimentară, o legătură de hidrogen, care este o asociaţie slabă dintre un atom electronegativ (acceptor) şi un atom de hidrogen legat covalent de un alt atom (donor). Atomul de hidrogen este mai aproape de donor comparativ cu acceptorul.

6 Figura 2. Reprezentarea schematică a modului în care se formează o legătură de hidrogen Legătura covalentă dintre donor şi atomul de hidrogen trebuie să fie dipolară, iar învelişul electronic al atomului acceptor trebuie să posede electroni de nelegătură care atrag sarcina δ + de pe atomul de hidrogen. Legăturile de hidrogen din apă sunt un exemplu clasic: un atom de hidrogen dintr-o moleculă este atras de o pereche de electroni din învelişul electronic extern al atomului de oxigen dintr-o moleculă învecinată. Tăria legăturii de hidrogen din apă este de aproximativ 5 Kcal/Mol, fiind mult mai slabă decât a legăturii covalente H-O (111 Kcal/Mol, Tabelul 1). O caracteristică importantă a legăturii de hidrogen este orientarea spaţială. În legăturile de hidrogen puternice atât donorul cât și atomul de hidrogen respectiv acceptorul sunt situaţi pe aceeaşi linie. Figura 3. Exemple de posibile legături de hidrogen din sistemele biologice Deoarece legăturile N-H sunt dipolare, atomii de azot pot fi donori într-o legătură de hidrogen, la fel ca atomul de oxigen din legăturile O-H ale altor molecule (incluzând molecula de apă). Azotul şi oxigenul pot fi acceptori în formarea legăturilor de hidrogen din sistemele biochimice. De exemplu, legăturile de hidrogen sunt importante în procesul de cataliză enzimatică, proces în care enzimele (macromolecule special care joacă rol de catalizatori) interacţionează cu

7 substratul (compuşi cu masă moleculară redusă). Prezenţa diverselor grupări (hidroxil OH, carbonil C=O, carboxilat -COO - sau amoniu -NH 3 +, grupărilor peptidică şi esterică) conferă moleculelor proprietatea de a fi solubile în apă (hidrofile). Aceste grupări conferă solubilitate proteinelor, acizilor nucleici sau carbohidraţilor. În contrast, substanţele nepolare, nu posedă grupări donoare sau acceptoare de hidrogen. Legăturile ionice În soluţii apoase, ionii simpli importanţi din punct de vedere biochimic (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+ şi Cl - ) nu sunt entităţi izolate. Fiecare dintre aceşti ioni este înconjurat de un strat de molecule de apă, care alcătuiesc un înveliş pentru aceste entităţi încărcate. Interacţiunile au loc preponderent între ioni şi partea dipolui apei care este încărcată diferit. O estimare a dimensiunii acestor ioni trebuie să includă şi moleculele de apă care-i înconjoară. Ionii joacă un rol important atunci când sunt transportaţi prin pori înguşti sau canalele din membranele celulare. Trecerea ionilor prin membrane este esenţială atât pentru transmiterea impulsurilor nervoase cât şi pentru stimularea contracţiei musculare. Majoritatea compuşilor ionici sunt destul de solubili în apă deoarece o cantitate apreciabilă de energie este eliberată prin legarea acestor ioni de moleculele de apă. Ionii opuşi hidrataţi au o tendinţă redusă de recombinare. Interacţiunile de tip van der Waals Fluctuaţiile aleatorii din distribuţia electronilor unui atom pot conduce la apariţia unor dipoli de tranziţie. Dacă doi atomi legaţi necovalent sunt unul în proximitatea celuilalt, dipolul de tranziţie al unuia va perturba norul electronic al celuilalt. Această fluctuaţie de sarcină generează un dipol de tranziţie şi în cel de-al doilea atom, după care aceşti doi dipoli sunt uşor atraşi unul de celălalt. Toate tipurile de molecule, atât polare cât şi nepolare, pot fi implicate în interacţii de tip van der Waals. În particular, acest tip de legături este responsabil pentru coeziunea dintre moleculele (lichide sau solide) nepolare care nu pot forma legături ionice sau de hidrogen cu alte molecule. În cazul în care atracţia de tip van der Waals dintre doi atomi este contracarată de repulsia dintre norii electronici ai celor doi atomi se poate spune faptul că cei doi atomi sunt în contact van der Waals. Fiecare tip de atom are o rază

8 de contact cu alţi atomi numită rază van der Waals. Energia unei interacţiuni de tip van der Waals este de aproximativ 1 Kcal/Mol, cu foarte puţin peste energia termică a moleculelor la temperature de 25 C. Astfel, interacţiunile de tip van der Waals sunt chiar mai slabe decât legăturile de hidrogen care în mod normal posedă o energie mai ridicată în soluţii apoase (de circa 1-2 Kcal/Mol). Atracţia dintre două biomolecule mari poate fi apreciabilă în situaţia în care aceste molecule au forme complementare, astfel încât pot fi implicate în mai multe contacte van der Waals atunci când sunt în proximitate. Contactele de tip van der Waals sunt interacţiuni des întâlnite în biochimie: interacţiunea anticorp-antigen sau legarea substratului în situsul catalitic (cavitatea) al unei enzime. Interacţiuni hidrofobe Moleculele nepolare nu conţin ioni sau legături dipolare şi din acest motiv nu pot fi hidratate. Deoarece aceste molecule sunt insolubile sau foarte puţin solubile în apă poartă numele de substanţe hidrofobe. Miezul sau partea centrală a majorităţii membranelor biologice, incluzând suprafaţa membranei celulare, este compus aproape exclusiv din părţile hidrocarbonate ale unor molecule (lipide) şi conţine foarte rar părți polare. O moleculă nepolară nu poate forma legături de hidrogen cu moleculele de apă, distorsionând aceste molecule şi forţându-le să formeze o cuşcă de legături de hidrogen în jurul acesteia, dar nu cu aceasta. În schimb, moleculele nepolare pot fi implicate în interacţiuni de tip van der Waals. Acest fapt conferă o tendinţă de asociere a moleculelor hidrofobe şi implicit de a nu se dizolva în apă. Specificitatea de legare. Rolul interacţiunilor slabe Este cunoscut faptul că existenţa mai multor legături necovalente conferă stabilitatea moleculelor biologice mari. Aceste interacţiuni conferă specificitate prin faptul că dictează împachetarea moleculelor mari sau modul de interacţiune dintre molecule diferite. Toate legăturile slabe sunt efective numai pe distanţe scurte, necesitând contactul eficient dintre grupările reactante. În cazul legăturilor necovalente se impune existenţa unei complementarităţi între suprafeţele care conţin grupările respective. Figura 4 (pagina 9) exemplifică o serie de legături slabe care guvernează interacţiunea dintre două proteine (sau segmente din aceeaşi proteină).

9 Figura 4. Tipuri de interacțiuni slabe care apar la contactul dintre două părţi distincte dintr-o proteină sau în cazul interacțiunilor bimoleculare (de tip proteină-proteină etc) ph-ul sistemelor biochimice Una dintre proprietăţile cele mai importante ale fluidelor biologice o constituie ph-ul. Sângele uman are un ph într-un domeniu îngust 7,35-7,45. În situația în care ph-ul scade sau crește peste acest interval acesta este un indiciu asupra unor simptome și boli. Dezechilibrele ph-ului pot indica: dereglări hormonale, probleme cardiovasculare, modificări ale greutății corporale, funcționarea inadecvată a bilei sau rinichiului, deficiențe ale sistemului imunitar, accelerarea distrugerii radicalilor liberi, probleme structurale sistemice (oase fragile, fracturi de șold, disconfort osos), probleme digestive, supraproducție de microorganisme (drojdii, fungi etc) sau chiar apariția tumorilor. Valoarea ph-ului citoplasmei celulei este de circa 7,2 în timp ce al mitocondriei este 7,8-8,2. Unele organite celulare au valori mai scăzute ale phului. De exemplu, lizozomii au un ph de circa 5. Astfel, valoarea concentraţiei protonilor este de circa 100 de ori mai ridicată decât cea din citoplasmă. O valoare optimă a ph-ului este esenţială pentru menţinerea structurii unor molecule şi determină funcţionarea optimă a acestora. Pe de altă parte, schimbarea dramatică a

10 ph-ului celular poate juca un rol important în controlarea activităţii celulare. De exemplu, ph-ul citoplasmei unui ou nefertilizat de arici de mare este de 6,6. La un minut după fertilizare ph-ul creşte la 7,2. Astfel schimbările de ph par să declanşeze atât creşterea cât şi diviziunea celulară. Valoarea ph-ului unui sistem biochimic este menținută cu ajutorul sistemelor tampon. Principalul sistem tampon la nivel extracelular este sistemul bicarbonat-acid carbonic (HCO 3 - /H 2 CO 3 ). Există și alte sisteme tampon care intervin pentru menținerea ph-ului: proteinele celulare (proteină acidă/proteinat), albuminele, globulinele plasmatice (hemoglobina / hemoglobinat și oxihemoglobina / oxihemoglobinat) și pompele protonice (proteine membranare care favorizează traficul în contracurent a ionilor de H + și K + prin membrana celulară). De asemenea din procesele metabolice rezultă acizi organici (piruvic, lactic sau cetoacizi) sau anorganici respectiv baze sau anioni organici (citrat, lactat sau acetat). Concentrația ionilor de H + din plasmă este mmol/l (ph= 7,35-7,45). Menținerea ph-ului plasmei se realizează prin 3 mecanisme: de tamponare, de compensare (respiratorie sau renală) sau de corectare. Mulţi compuşi din celulă conţin numeroase grupări care pot fi disociate. Valoarea pka-ului unei grupări acide este egală cu ph-ul la care jumătate din molecule sunt disociate, iar cealaltă jumătate sunt neutre. Figura 5. Disocierea grupării fosfat din acizii nucleici la ph 7 Ionii fosfat sunt prezenţi în cantităţi considerabile în celulă şi sunt factori importanţi în menţinerea (tamponarea) ph-ului citoplasmei. În acizii nucleici grupările fosfat se regăsesc sub forma unui diester. Valoarea pka-ului corespunzător disocierii protonului grupării fosfat este de aproximativ 3 (Figura 5). Astfel, la ph neutru (ph 7) fiecare grupare fosfat din acizii deoxiribonucleic (ADN) sau ribonucleic (ARN) este încărcată negativ. Direcţia reacţiilor biochimice Dat fiind faptul că moleculele biochimice sunt menţinute la temperatură şi presiune constantă, direcţia unei reacţii chimice poate fi intuită pe baza energiei

11 potenţiale sau energiei libere. Modificările energiei libere caracteristice unei reacţii sunt influenţate de temperatură, presiune, concentraţia iniţială a reactanţilor şi produşilor sau ph. De asemenea, valoarea energiei libere standard indică sensul (deplasarea echilibrului) unei reacţii biochimice. Constantele de disociere. Afinitatea moleculelor partenere Conceptul de echilibru chimic se aplică şi în cazul legării unei molecule la o altă moleculă. De exemplu, legarea unui ligand (hormonul insulină sau adrenalină) la receptorul său de pe suprafaţa unei celule poate activa o întreagă cale metabolică. O altă situaţie este legarea specifică a unei proteine la o secvenţă de nucleotide (perechi de baze) dintr-o moleculă de ADN care poate determina o intensificare sau reducere a copierii informaţiei genetice din vecinătatea acelei secvenţe. Cel mai frecvent intensitatea legării poate fi descrisă prin intermediul constantelor de disociere (K d ) ale complecşilor rezultaţi. Pentru perechile proteinăproteină sau proteină-adn constantele de disociere de sub 10-9 M reflectă o interacţiune puternică, în timp ce o valoare mai mare de 10-6 M respectiv 10-3 M indică interacţiuni medii respectiv modeste. Constantele de disociere M au fost determinate în cazul unor receptori (CD2 de pe suprafața limfocitelor T) care sunt implicați în interacțiuni tranzitorii. Constanta de disociere a lizozimului de un anticorp (altă proteină) este de 2,2 x 10-8 M. La o analiză mai detaliată s-a constatat faptul că 16 aminoacizi ai lizozimului interacționează cu 17 resturi ale anticorpului (au fost identificate 12 legături de hidrogen între parteneri). În schimb, sistemul cu afinitatea cea mai mare (constanta de disociere cea mai mică) o constituie interacțiunea dintre avidină sau streptavidină (proteine cu mase moleculare de peste ) și o moleculă mai mică numită biotină (vitamina B7). Constanta de disociere a sistemului este de ordinul M. Reacţii redox în procesele biochimice Într-o reacţie redox modificările potenţialului electric sunt datorate schimbărilor cumulate ale potenţialelor de reducere din etapele de oxidare sau reducere. Deoarece toate formele de energie sunt interconvertibile schimbările energiei libere pot fi corelate cu cele ale potenţialului: G (Kcal/Mol) = - n F E (V) ATP-ul este o sursă de energie pentru procesele celulare Energia de hidroliză a ATP-ului (adenozin trifosfatului) la ADP (adenozin difosfat) este

12 folosită (prin intermediul unor sisteme enzimatice) la: sinteza proteinelor sau oligozaharidelor, deplasarea celulelor, contracţia musculară, transportului moleculelor prin membranele celulare. Energia de activare şi viteza de reacţie Energia de activare este energia necesară pentru iniţierea unei reacţii. Doi factori importanţi de care depinde viteza unei reacţii chimice sunt concentraţia reactanţilor şi ph-ul soluţiei. Teoria stării de tranziţie este utilizată pentru stabilirea unor corelaţii între structură şi reactivitate. În starea fundamentală sunt consideraţi entităţi fizice numai reactanţii pe când în starea de tranziţie sunt cosiderate numai speciile instabile (energia liberă cea mai mare). Astfel, starea de tranziţie este caracterizată printr-un maxim în diagrama de reacţie, în care se urmăreşte dependenţa energiei speciilor în decursul reacţiei. Biocatalizatorii (enzimele) acţionează în aşa manieră încât micşorează energia liberă a stării de tranziţie comparativ cu reacţia necatalizată. Diferenţa dintre valorile G pentru reacţiile catalizate E a şi necatalizate (E a ) indică eficienţa catalizatorului.