Asocieri inovative de fitocompusi ai speciilor de Solanum si Camelina sativa cu eficacitate dermo-epidermica demonstrata la nivel celular si molecula

Transcriere

1 Asocieri inovative de fitocompusi ai speciilor de Solanum si Camelina sativa cu eficacitate dermo-epidermica demonstrata la nivel celular si molecular PROIECT 21 PTE BIOCAMISOL

2 CONCEPT Complementaritatea efectelor descrise de literatura de specialitate pentru uleiul de camelina (proprietati emoliente, antioxidante, antiinflamatoare, hidratante si regeneratoare) si glicoalcaloizii steroidici (actiune ambivalenta antifungica, antimicrobiana, insecticida, pe de-o parte si antiproliferativa si antiinflamatoare pe de alta) a dus la ideea asocierii celor doua preparate, in scopul obtinerii unor prototipuri cu aplicatie directionata in agricultura, respectiv terapeutica medicala.

3 MECANISME CELULARE SI MOLECULARE RELEVANTE PENTRU TESTAREA PRINCIPIILOR ACTIVE LA NIVEL DERMO-EPIDERMIC SCREENING DE CITOTOXICITATE PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA, cu relevanta cutanata Evaluarea activitatii metabolice corelativ cu eliberarea LDH (lactat dehidrogenazei) ca indicator de stress citotoxic pe culturi celulare de keratinocit, fibroblast si endoteliu vascular SCREENING DE EFICACITATE PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA Tinta terapeutica: REGENERARE TISULARA SI INHIBAREA PROCESELOR INFLAMATORII la nivel de epiderm, primul strat cu funcţie de barieră a pielii (keratinocite) inflamaţie, stress oxidativ, diferentiere epidermala si turn-over celular; la nivel de derm, - status proliferativ, sinteza proteinelor din matrixul extracelular (colagen), inflamaţie, stress oxidativ, turn-over celular; la nivel de endoteliu vascular, cu rol major în homeostazia pielii prin furnizarea de oxigen, nutrienţi şi hormoni (celule endoteliale umane) inflamaţie, stress oxidativ.

4 MATERIAL BIOLOGIC epiderm reprezentat in modele experimentale de linia celulara standardizata HaCaT celule imortalizate, cu potential de diferentiere dependent de calciu derm - reprezentat in modele experimentale de linia celulara standardizata HS27 fibroblast dermic uman, pasaj endoteliu vascular - reprezentat in modele experimentale de linia celulara standardizata HUVEC celule primare endoteliale umane din vena ombilicala COMPUSI BIOACTIVI GLY- glicoalcaloizi steroidici extrasi, purificati si standardizati din deseu vegetal Solanum sp. Cam ulei de camelina extras la rece din Camelina sativa soiul Madalina, cultura ecologica Asocieri GLY/CAM in diferite proportii Stimuli pro-inflamatori LPS- lipopolizaharid din Escherichia coli mimarea atacului bacterian / fungic la nivel cutanat TNFalfa inductor al inflamatiei sistemice nespecifice

5 IMPACT CITOTOXIC MINIM PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA

6 IMPACT CITOTOXIC MINIM PENTRU FITOCOMPUSI DIN SOLANUM SI CAMELINA asociati Cresterea concentratiei de ulei de camelina in combinatiile de fitocompusi reduce limita de citotoxicitate

7 EFECT antiinflamator semnificativ al GLY pe KERATINOCITE si FIBROBLASTI exprimat prin inhibarea citokinelor proinflamatorii IL6 si IL8 linia celulara HaCaT linia celulara HS27 Efectul GLY la doze mari (1-4μg/ml) il recomanda ca antiinflamator semnificativ, prin reducerea drastica a citokinelor IL6 si IL8 atat la keratinocite, cat si fibroblasti Complexul Cam are un rol complementar, acela de a reface vasculatura dermica in cadrul procesului de regenerare tisulara, sugerat de stimularea factorului proangiogenic VEGF. Efectele au fost confirmate si prin studii PCR de modulare la nivel genic a mediatorilor de inflamatie IL6 si IL8

8 Efect antiinflamator endotelial la nivel de expresie a moleculelor de adeziune ICAM si VCAM In procesul de inflamatie la nivel vascular, celulele endoteliale sunt activate si exprima molecule cu rol in adeziunea monocitelor la endoteliu: VCAM-1 SI ICAM-1. Desi expresia ambelor molecule este crescuta in inflamatie, VCAM-1 are un rol predominant in initierea acestui proces. ICAM -1 este exprimat cu preponderenta in microvasculatura. In cazul stimularii cu LPS (mimare atac bacterian) cele mai active componente antiinflamatoare pe vase sanguine mici sunt Gly 50ng/ml si combinatia A1, iar pe vase de sange mari Cam 0.04%. In cazul stimularii nespecifice cu TNF alfa, toate componentele testate reduc expresia VCAM (molecula de adeziune endoteliu-monocit specifica vaselor mari), precum si expresia ICAM caracteristica microvasculaturii, cu exceptia combinatiei A4.

9 Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) marcare cu DCFH-DA, respectiv HE citometrie in flux Linie endotelia la HUVEC Compusii Gly, Cam si variantele de asociere A1, A2, A3 reduc radicalii liberi oxigenati prezenti intracelular ca urmare a stimularii pro-inflamatorii, atat sistemica (TNFα), cat si bacteriana (LPS). A4 se remarca in inflamatia bacteriana in reducerea O 2 -

10 Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) marcare cu DCFH-DA, respectiv HE citometrie in flux Linia HS27 fibroblasti dermici

11 Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) marcare cu DCFH-DA, respectiv HE citometrie in flux Linia HaCaT keratinocit uman imortalizat

12 Efect antioxidant intracelular prin monitorizarea speciilor de oxigen reactive (peroxid de hidrogen si anion superoxid) marcare cu DCFH-DA, respectiv HE citometrie in flux Linia HaCaT keratinocit uman imortalizat GLY este un agent puternic in prevenirea stresului oxidativ produs de inflamatie, inhiband ambele specii de oxygen reactive. CAM reduce in special anionul superoxid intracelular din fibroblasti si peroxidul de hidrogen din keratinocite, sugerand un efect de potentare a Gly la acest nivel Este de mentionat efectul antioxidant celular al Gly si Cam in conditii inflamatorii asociate cu stimuli bacterieni (LPS), inhibitia speciilor reactive de oxygen ducand la protectia celulara in patologii cutanate cu componenta inflamatorie.

13 Reepitelizare prin diferentiere keratinocite (evidentierea straturilor epidermei: bazal, granulos si cornos prin expresia keratinei 5/14; transglutaminazei-1 si involucrinei), corelata cu stimularea multiplicarii celulare; Concentratia externa de calciu regleaza diferentierea keratinocitelor in vitro. Evidentierea celor trei proteine membranare markeri de diferentiere a fost realizata prin marcarea cu anticorpi specifici. Uleiul de camelina stimuleaza expresia citokeratinei, inducand diferentiere keratinocitara inca din stratul bazal. Gly induce preponderent supraexpresiei transglutaminazei-1, deci progresia stratului spinos. Compusii bioactivi stimuleaza turn-overul keratinocitelor atat in conditii nediferentiate (mediu sarac in calciu), cat si de inducere a diferentierii (12mg calciu), efect ce sustine procesul de regenerare epidermala.

14 REFACERE DERMICA PRIN STIMULAREA DINAMICII CELULARE A FIBROBLASTILOR SI A SINTEZEI DE COLAGEN Regenerarea dermica modulata de extractele vegetale a fost evaluata prin determinarea statusului proliferativ la nivelul secventialitatii ciclului celular. In conditii pro-inflamatorii mimate prin stimularea cu TNFα, cand rata de proliferare este in declin, uleiul de camelina amplifica progresia mitotica, marind rata de diviziune celulara, ceea ce sugereaza un rol important in procesele de regenerare dermica dupa agresiunea bacteriana/ fungica, asociata cu inflamatia cutanata. Determinarea colagenului total - marcare cu Sirius Red/Fast Green- In urma colorarii cu Sirius Red se observa fibrile roz de colagen, cu verde fiind marcata proteina non-colagenoasa. Crestere a sintezei de colagen in celulele tratate cu Camelina 0.04% (143%) dar si in cazul fibroblastilor tratati cu Gly 50ng/ml (146%), precum si a combinatiilor Cam+Gly

15 CONCLUZII - Explorarea unor mecanisme celulare, completate de expresie genotipica, pentru demonstrarea efectelor antiinflamator, antioxidant si de regenerare cutanata Modelele experimentale utilizate in acest screening au avut o mare complexitate si au urmarit simularea in vitro a conditiilor unui atac bacterian sau fungic (tratare cu LPS), dar si cele ale instalarii unui status inflamator sistemic nespecific (TNFalfa). Efectul antiinflamator a fost demonstrat prin qrt-pcr si citometrie in flux la nivelul factorilor pro-inflamatori IL6, IL8, VEGF si a moleculelor de adeziune ICAM si VCAM in special pentru GLY 50ng/ml si combinatia A4= Cam 0.04%+Gly 70ng/ml; GLY a indus efect antioxidant marcant prin reducerea speciilor reactive de oxigen intracelulare,corelativ cu modularea catalazei/superoxid-dismutazei, completat de actiunea moderata si selectiva pe anumiti radicali liberi a Cam. Inducerea regenerarii cutanate prin reepitelizare prin diferentiere keratinocite (supraexpresia keratinei 5/14; transglutaminazei-1 si involucrinei), corelata cu stimularea multiplicarii celulare; Refacere dermica prin stimularea dinamicii celulare si a sintezei de colagen a fost realizata in sistemele experimentale investigate de ambii compusi si de asocierea lor, acestia potentandu-si reciproc anumite cai de actiune celulara. Prin evidentierea acestor efecte induse de GLY si Cam s-a realizat largirea spectrului de activitate biologica si s-au identificat noi tinte terapeutice, diferite de efectul antimicrobian clasic ce conduc la dezvoltarea de noi produse bazate pe valorificarea potentialului agricol (deseuri de planta, respectiv specii cu adaptabilitate mare si potential agricol imens)