PROFILUL MOLECULAR AL CANCERULUI MAMAR: DE LA GENE LA TRĂSĂTURI MORFOLOGICE Carmen Ionescu, Cornelia Amălinei, Raluca Balan, Adriana Grigoraş, Irina-Draga Căruntu Disciplina Histologie Universitatea de Medicină şi Farmacie Gr.T. Popa Iaşi THE MOLECULAR PROFILE OF BREAST CANCER: FROM GENES TO HISTOLOGICAL FEATURES (Abstract): During the last decade, one of the main directions in the breast cancer research was oriented to the genetic profile, focusing on a deeper understanding of the molecular background that sustains the biological features (such as histological grade and metastasis potential) as well as on a better identification of some specific patterns, correlated with prognosis and therapeutic responses. The definition of new subtypes, in accordance with the genetic expression confirms, at the molecular level, the already existing concept of clinical and histological heterogeneity for the breast cancer. Despite a large number of papers dedicated to this subject, there are still unclear issues in the characterization of the molecular subtypes and, most probably, the number of subtypes known today is not the final one. This review, based on the information available in the publication mainstream, aims to offer a synthesis of the most recent concepts implemented in the breast carcinoma diagnosis. The text highlights the following topics: (i) the histological structure of the normal mammary gland, compulsory for the implementation of the new taxonomy and the hypothesis regarding the origin of breast cancer; (ii) the role of Stanford group in defining the genetic signature of breast cancer; (iii) the development and characteristics of the genetic tests available for breast cancer investigation; (iv) the usage of immunohistochemistry, as an alternative solution for genetic tests; (v) the molecular subtypes in correlation with immunohistochemical markers and histological features. KEY WORDS: BREAST CANCER, MOLECULAR CLASSIFICATION, GENETIC TESTS, HISTOLOGICAL CLASSIFICATION Corespondenţă: Prof. dr. Irina-Draga Căruntu, Universitatea de Medicină şi Farmacie Gr.T. Popa Iaşi, Disciplina Histologie, str. Universitaţii, nr.16, e-mail: irina_caruntu@yahoo.com *. Cancerul mamar (CM) este principala cauză de mortalitate la sexul feminin, fiind raportate, anual, peste 500000 de decese [1]. În ultimul deceniu, în abordarea diagnostică şi terapeutică a CM au intervenit modificări majore, ca rezultat al aprofundării mecanismului patogenic la nivel genic. Astfel, CM este considerat în prezent un ansamblu de boli heterogene, individualizate prin diferenţe la nivel molecular, histopatologic şi clinic, datorate în principal punctului iniţial de origine, reprezentat de diferite linii celulare şi/sau de celule stem existente în teritoriul glandei mamare [2]. Factorii clinici, histopatologici şi moleculari larg acceptaţi ca având valoare de factori de prognostic includ: vârsta, gradul tumoral, mărimea tumorii, statusul limfoganglionilor, prezenţa metastazelor, tipul histologic, expresia receptorilor hormonali (receptorul estrogenic (RE) şi receptorul progesteronic (RP)), expresia receptorului 2 al factorului de creştere epidermic (eng. Epidermal Growth Factor Receptor EGFR/HER2/neu), invazia peritumorală vasculară [2]. * received date: 21.01.2011 accepted date: 24.03.2011 142
Clasificarea CM în raport de statusul receptorilor hormonali în două clase majore (tumori pozitive şi, respectiv, negative) a avut un rol crucial în managementul terapeutic al pacientelor, prin terapia endocrină care a prelungit semnificativ supravieţuirea fără reluare de evoluţie şi supravieţuirea totală. Totuşi, un procent important din cazurile cu receptori hormonali pozitivi nu răspund la tratamentul endocrin chiar din momentul iniţierii acestuia (rezistenţa intrinsecă), sau dezvoltă rezistenţă în timp (rezistenţa dobândită). Cazurile care nu se încadrează în tiparul de răspuns terapeutic aşteptat au condus, inevitabil, spre necesitatea identificării şi validării unor alţi markeri prognostici şi predictivi, care pot facilita o abordare individualizată a tratamentului. Consecutiv, direcţiile de cercetare au fost orientate spre studierea expresiei genice corespunzătoare CM, profilul genic demonstrat stând la baza propunerii de introducere a unei clasificări moleculare [2], cu relevanţă directă pentru stabilirea prognosticului şi alegerea tratamentului. Această prezentare urmăreşte să faciliteze accesul cititorului la noile teorii şi concepte referitoare la CM, obligatorii pentru monitorizarea clinică şi terapeutică a cazurilor. 1. PROFILUL CELULAR ŞI MOLECULAR AL GLANDEI MAMARE NORMALE Un scurt rapel asupra histoarhitectoniei glandei mamare, cu detaliere a caracteristicilor moleculare ale celulelor constituente, este absolut necesar pentru înţelegerea terminologiei utilizate în clasificarea moleculară a CM şi a ipotezelor legate de linia celulară de origine în carcinogeneză. În acest context, este important să subliniem că raportarea la originea subtipurilor moleculare se face în raport de diferenţierea liniilor celulare [3,4], fenotipul unui subtip molecular reflectând fenotipul celulei de origine [5]. Glanda mamară are o histoarhitectonie de tip tubulo-alveolar compus, fiind formată din lobi separaţi de ţesut conjunctiv dens şi ţesut adipos. În fiecare lob, componenta secretorie alveolară se continuă cu un sistem de ducte intralobulare care, prin confluare, formează ductele interlobulare şi, respectiv, canalele galactofore, cu deschidere proprie, printr-un sinus lactifer, la nivelul mamelonului. Alveolele (elementele secretorii) şi ductele sunt structuri tubulare tapetate de un epiteliu bistratificat: stratul intern, continuu, format din celule epiteliale care delimitează lumenul (denumite şi celule luminale) şi stratul extern, uneori discontinuu, format din celule mioepiteliale în contact cu membrana bazală (denumite şi celule bazale). Această organizare este menţinută prin caracterul polarizat al celulelor luminale, prin joncţiunile inter-celulare şi cele stabilite cu membrana bazală, precum şi prin participarea micromediului extern, care intervine prin dezvoltarea de forţe mecanice şi transmiterea de semnale celulare [6]. Sub raportul markerilor moleculari, celulele epiteliale luminale exprimă citokeratine (CK) tip 8, 18 şi 19, iar celule mioepiteliale exprimă CK de tip 5/6, 14 şi 17. Diferenţierea prin citokeratine nu este însă absolut general valabilă, existând posibilitatea ca celulele luminale să prezinte citokeratine considerate caracteristice pentru celulele mioepiteliale, alături de alţi markeri specifici ca vimentina, actina muşchiului neted, TP63, CD10 şi proteina S-100 [7]. În a doua jumătate a ciclului ovarian, sub influenţa progesteronului, în ductulii terminali celulele epiteliale proliferează, apare o activitate secretorie incipientă şi, consecutiv, lumenele se lărgesc; în ţesutul conjunctiv intralobular se acumulează fluid şi glicozaminoglicani, determinând o uşoară mărire în volum. 143
Procesul poate fi amplificat în cazul fertilizării sau se revine la structura iniţială, în absenţa fertilizării şi a prăbuşirii nivelelor de progesteron. În sarcină şi lactaţie, glanda mamară îşi modifică semnificativ dimensiunile datorită dezvoltării alveolelor, ca un proces de înmugurire din capetele terminale ale ductelor terminale, lobulii crescând şi ţesutul adipos dintre lobuli diminuând, în încercarea de a compensa mărirea lobulilor. Existenţa celulelor stem la nivelul glandei mamare a fost demonstrată prin studii experimentale umane şi murine. Capacitatea de a iniţia noi linii celulare (epiteliale luminale şi mioepiteliale) poate explica variaţiile histoarhitectonice şi histofiziologice ale glandei mamare în raport cu vârsta. Deşi incomplet definit, profilul imunohistochimic pentru celulele stem mamare include citokeratine 19/14, EpCAM, CD49f şi SSSEA-4 [8]. Cu referire strictă la carcinogeneza mamară, a fost formulă ipoteza conform căreia rolul de promotor revine unei populaţii de celule tumorale cu caracteristici de celule stem, numite celule stem canceroase [9,10]. Fiecare dintre cele cinci subtipuri moleculare de CM (luminal A, luminal B, HER2, bazal-like, normal-like) poate avea la origine celule stem/precursoare diferite [11], care reflectă diferite stadii de diferenţiere a celulelor epiteliale mamare, explicând astfel heterogenitatea morfologică şi moleculară a CM [12-16]. 2. SEMNĂTURA GENETICĂ A CANCERULUI MAMAR ROLUL GRUPULUI STANFORD În ansamblul cercetărilor asupra expresiei genice a CM, anul 2000 reprezintă momentul de referinţă prin rezultatele grupului de la Stanford, condus de Perou [17]. Folosind teste genetice pentru analiza ADN-ului complementar (ADNc) corespunzător unui număr de 8102 gene umane, în 65 de fragmente tisulare provenind de la 42 de paciente diagnosticate cu CS, autorii au demonstrat că diversitatea fenotipică a tumorilor de sân este asociată, în corespondenţă directă, cu o diversitate a expresiei genice. Din cele 8102 gene a fost selectat un subset de 456 gene care reflectă proprietăţile tumorale intrinseci, acesta fiind denumit subsetul de gene intrinseci. Modelul expresiei genice a condus spre definirea a două subgrupe principale, în separarea cărora un rol major, de factor discriminant, a revenit RE. Identificarea unui profilul genic diferit pentru subgrupa RE pozitivă (RE+) şi subgrupa RE negativă (RE ) accentuează ideea conform căreia CM RE+ şi CM RE sunt două entităţi patologice diferite, chiar dacă trăsăturile histopatologice sunt identice [6,18]. Autorii au propus introducerea a 4 subtipuri moleculare diferite: RE+ subtip luminal, RE subtip Erb-B2 pozitiv, RE subtip bazal-like, RE subtip neclasificabil (normal-like). Ulterior, utilizând instrumente bioinformatice complexe de tip grupare ierarhică, autorii au diferenţiat subtipurile luminal A şi luminal B [5]. Extrem de important, expresia subtipurilor genice este concordantă între tumorile primare şi leziunile ulterioare metastatice apărute ani mai tarziu [19]. Aceste 5 subtipuri moleculare au fost confirmate în seturi de date independente, care au demonstrat că profilul molecular poate fi corelat cu evenimentele şi trăsăturile biologice specifice carcinogenezei, şi anume: potenţialul metastatic [20-22] sau gradul histologic [23], şi poate identifica expresiile favorabile sau nefavorabile asociate prognosticului [20-23] şi răspunsului la terapie [24]. 144
Concret, subtipurile sunt asociate cu diferenţe în rezultatul clinic apărut, apreciat ca supravieţuire fără evenimente recurente (eng. Recurrence-Free Survival RFS) şi supravieţuirea generală (eng. Overall Survival OS): subtipul luminal A are perioada cea mai mare de supravietuire, subtipurile basal-like şi HER2+ au perioada cea mai scurtă, iar subtipul luminal B are o perioadă intermediară de supravieţuire. 3. TESTE GENETICE PENTRU CANCERULUI MAMAR: CONCEPERE, CARACTERISTICI MammaPrint (70-gene assay) şi Oncotype DX (21-gene RS assay) sunt în prezent cele mai utilizate teste de stabilire a profilului genic, în Europa şi în SUA. 3.1. MammaPrint - The 70-Gene Assay (Testul celor 70 gene) MammaPrint a fost primul test care a primit, în SUA, aprobarea Food şi Drug Administration (FDA), fiind încadrat în Clasificarea FDA a testelor noi de diagnostic, ca test prognostic pentru femeile sub 60 de ani cu CM RE+ sau RE, fără afectare limfoganglionară. MammaPrint, conceput în cadrul Netherlands Cancer Institute, include 70 de gene. Profilul genic identificat, inclus într-o analiză multivariată, are valoare de predictor independent puternic pentru supravieţuirea liberă de boală la distanţă (eng. distant disease-free survival DDFS) şi supravieţuirea generală, fiind aplicat şi pentru aprecierea beneficiului chimioterapiei în asociere cu terapia hormonală [25,26]. Testul este validat prin studii realizate în parteneriat, cu implicarea Translational Breast International Group (TRANSBIG) şi a numeroase centre de cercetare europene [27,28]. Testul utilizează ARNm proaspăt, necesitând mostre congelate de ţesut tumoral proaspăt sau ţesuturi păstrate în soluţii care asigură conservarea ARN-ului fapt care determină o serie de probleme tehnice, limitând introducerea lui pe scală largă. 3.2. The 76-Gene Assay (Testul celor 76 gene) Un alt test genetic include un număr de 76 de gene (60 de gene pentru pacienţii cu tumori RE+ şi 16 gene pentru pacienţii cu tumori RE ), referate drept semnătură genică [22]. Aplicarea testului a indicat o sensibilitate de 93% şi o specificitate de 48% în predicţia dezvoltării metastazelor, la 5 ani. Conform rezultatelor raportate, profilul determinat prin investigaţia celor 76 de gene poate fi considerat un factor de prognostic puternic pentru CM instalat atât în premenopauză, cât şi în postmenopauză, şi pentru tumorile mici (1-2 cm) [29]. Limite ale testului sunt însă acceptate pentru tumorile RE, numărul analizat fiind prea mic pentru rezultate valide. Testul necesită de asemenea extracte ARNm proaspete sau congelate, similar cu MammaPrint. 3.3. The HOXB13:IL17BR Assay (Testul HOXB13:IL17BR) Conceput la Massachusetts General Hospital [30], testul HOXB13:IL17BR, rezultat din raportul expresiei a două gene, anume gena homeobox HOXB13 şi receptorul IL 17B (IL17BR), are valoare predictivă pentru supravieţuirea liberă de boală (DFS). Genele HOX controlează morfogeneza şi, de asemenea, au rol în menţinerea specificităţii ţesutului [31] HOXB13 poate interacţiona cu receptorul RE şi, consecutiv, superexpresia sa poate contribui la rezistenţa la tamoxifen. Rolul IL17BR în CM este mai puţin clar stabilit, dar gena IL17BR, localizată pe 3p21, este frecvent pierdută. O explicaţie pentru corelaţia între IL17BR şi prognostic este că expresia scăzută a genei se corelează cu pierderea genelor supresoare tumorale localizate pe crs. 3p21. Valoarea prognostică a raportului HOXB13:IL17BR a fost validată în mai multe trialuri clinice [32,33]. Testul HOXB13:IL17BR (H/I) utilizează fragmente tisulare fixate în formol şi incluse la parafină, fiind comercial disponibil în SUA. 145
3.4. Oncotype DX - The 21-Gene RT-PCR Assay (Testul celor 21 gene) Deşi profilele genice obţinute prin testele ADN (de exemplu The 70-gene assay) au valoare prognostică, aplicabilitatea lor în practica curentă este mult limitată deoarece tehnica necesită ţesut proaspăt congelat. Pentru a depăşi aceste impedimente, a fost dezvoltat Oncotype DX (The 21-Gene RT-PCR Assay), bazat pe o metodă RT-PCR care permite cuantificarea expresiei genice în secţiuni de ţesut tumoral fixat, inclus în parafină [34]. Utilizarea acestei metode a condus la selectarea unui panel format din 5 gene de referinţă (ACTB beta-actina, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC) şi 16 gene în relaţie tranformarea malignă (gene de proliferare: Ki-67, STK15, survivină, CCNB1 - ciclină B1, MYBL2; gene de inavzie: MMP11 stromolisină 3, CTSL2 catepsină L2; gene HER2: GRB7, HER2; gene pentru estrogen: RE, RP, BCL2, SCUBE2; alte gene: GSTM1, CD68, BAG1) [35-37]. Aceste gene, introduse într-un algoritm, au permis calcularea unui scor de recurenţă (eng. The 21-recurrence score) aplicabil pentru fiecare caz în parte. Rezultatele aplicării testului au indicat absenţa beneficiilor terapeutice post-chimioterapie adjuvantă numai în cazul pacienţii pentru care Oncotype DX a apreciat risc minim de recidivă, 94,95% din pacienţii cu CM RE+, cu sau fără implicare limfoganglionară având răspuns pozitiv la chimioterapie [38,39] Testul şi algoritmul au fost validate printr-un trial multicentric [35] şi patru studii publice [40]. Totuşi, un inconvenient major în aprecierea calităţii acestui test este datorat faptului că nu a fost realizată o comparaţie între prognosticul de recurenţă apreciat prin profilul genetic şi prognosticul de recurenţă apreciat prin metode conveţionale, în cadrul aceleiaşi populaţii. Oncotype DX a fost introdus în practica clinică fără a necesita aprobarea FDA, iar utilizarea lui extrem de largă este explicată în principal prin faptul că poate fi practicat pe material biologic arhivat (ţesut prelevat, fixat în formol şi inclus în parafină). Testul a fost inclus în 2007 în ghidul de markeri tumorali al American Society of Clinical Oncology (ASCO), ca element de referinţă pentru predicţia riscului de recurenţă şi indicator pentru chimioterapie la pacientele cu CM RE+, fără afectare limfoganglionară, tratate anterior cu terapie adjuvantă. Punctele slabe ale acestui test rezultă din limitarea la grupul de paciente RE+ şi din lipsa datelor certe asupra grupului cu risc intermediar. 3.5. Testele genetice între beneficiile şi limitele rezultatelor Compararea potenţialului prognostic al testelor genice [41] a relevat rate ridicate de concordanţă (cu excepţia HOXB13:IL17BR), deşi nu există o suprapunere a panelelor genice specifice fiecărui test. Acest fapt sugerează că toate testele genice identifică caracteristici biologice comune care sunt predictive pentru evoluţia pacienţilor. Aplicarea testelor de analiză genică a confirmat conceptul de heterogenicitate moleculară în CM. Deşi numărul de studii dedicate cercetării aprofundate a profilului molecular al CM este în creştere, literatura de specialitate semnalează însă existenţa a multiple probleme, încă nerezolvate, referitoare la subtipurile moleculare. Cel mai probabil, numărul de subtipuri / clase moleculare incluse în clasificare nu este definitiv [6]. Existenţa diferenţelor în tentativele de definire certă a subtipurilor moleculare poate fi explicată prin faptul că în procesarea datelor obţinute prin investigaţia genetică se utilizerază metodele statistice bazate, cel mai frecvent, pe grupări ierarhice nesupravegheate, care subclasifică tumorile în funcţie de o serie de profiluri de expresie similare [42]. 146
Chiar dacă scopul principal al metodei este descoperirea unor noi clase moleculare, se înregistrează limite inerente în principal datorită faptului că grupurile de eşantioane nu sunt stabilite absolut aleatoriu, ci există un grad de subiectivitate care porneşte de la utilizarea datelor patologice şi clinice. Cu toate că în seriile de CM analizate cele 3 clase majore subtipul luminal, subtipul HER+ şi subtipul bazal sunt întotdeauna identificate, gradul de variabilitate legat de numărul de cazuri şi de gene studiate face ca până la 20% din tumorile bazale să poată fi atribuite clasei luminale [43]. De asemenea, este recunoscut faptul că există foarte puţine date asupra reproductibilităţii biologice a testelor genice, potenţialului de contaminare al tumorilor mici invazive prin ţesutul mamar normal, modului în care o biopsie practicată anterior poate modifica expresia genică, sau asupra utilităţii testelor în CM în stadii avansate, inclusiv metastatice [44]. Toate aceste probleme constituie potenţiale direcţii de cercetare şi, în consecinţă, pentru a putea introduce criterii de diferenţiere fiabile, sunt necesare serii mari de grupuri de control analizate omogen, astfel încât să poată fi dezvoltată o metodă certă de definire a unui subtip tumoral, inclusiv prin atribuirea unui eşantion individual reprezentativ [6]. 4. TEHNICA IMUNOHISTOCHIMICĂ ŞI MARKERII SUROGAT O POSIBILĂ SOLUŢIE ALTERNATIVĂ PENTRU TESTELE GENETICE (ANALIZA GENICĂ) Deşi există sisteme de microarray care includ numai genele cheie (MammaPrint, Oncotype DX, PAM50) şi care permit studiul profilului genic, preţul acestora împiedică cel puţin momentan generalizarea utilizării lor pentru stadializarea clinică. Din acest motiv s-au căutat soluţii care să reproducă analiza expresiei genice şi categoriile de clasificare. Imunohistochimia oferă posibilitatea de identificare a unor caracteristici moleculare tumorale care au valoarea de markeri alternativi, surogat, în corespondenţă cu profilul genic. Pe de o parte, tehnica permite încadrarea în cele 5 subtipuri majore definite conform clasificării moleculare. Pe de altă parte însă, sunt semnalate neconcordanţe în raport de tiparul strict al clasificării de exemplu prin existenţa tumorile HER2+ care sunt RE+ [19], sau a unor subtipuri luminal B şi luminal C care sunt sunt ER [6]. Aceste constatări, datorate nivelului înalt de heterogenitate al CM, unamin recunoscut, determină o limitare intrinsecă şi specifică în utilizarea tehnicii imunohistochimice [2]. Markerii imunohistochimici surogat nu permit deocamdată o clasificare perfect suprapusă peste clasificarea bazată pe semnătura genetică, poate şi datorită faptului că aceasta din urmă nu este complet structurată (în baza limitelor prezentate anterior), absenţei consensului în interpretarea fiecărui subtip molecular şi variaţiilor de metodologie imunohistochimică între laboratoare. Cu toate acestea, definirea subtipurilor moleculare şi corelaţiile existente cu markerii imunohistochimici operaţionali deschid perspectivele pentru o predicţie a prognosticului şi o decizie de tratament individualizat, la momentul diagnosticului primar. 147
5. SUBTIPURI ÎN CLASIFICAREA MOLECULARĂ: CARACTERIZARE, CORELAŢII CU MARKERII IMUNOHISTOCHIMICI ŞI CLASIFICAREA HISTOLOGICĂ Subtipurile de CM, introduse prin clasificarea moleculară, diferă de entităţile definite clasic [45,46] pe baza caracteristicilor arhitecturale, patologice, precum şi a profilului imunohistochimic. 5.1. Tumorile RE pozitive Subtipul RE+ menţine expresia unor gene tipice celulelor epiteliale luminale, anume genele pentru citokeratine cu greutate moleculară mică (8/18) [5,11,47-49], şi genele legate de activarea/supraexpresia ER [6]. Cu referire strictă la CM ereditar, sunt prezente mutaţii ale genei BRCA2 [6]. În această clasă au fost încadrate iniţial două subtipuri diferite, denumite subtip luminal A şi subtip luminal B, iar recent a fost identificat un al treilea subtip luminal C. Sub raportul originii, subtipul de cancer luminal este asociat celulelor luminale. Studiile axate pe implicarea celulelor stem mamare şi a etapelor de diferenţiere a acestora în carcinogeneză oferă însă informaţii suplimentare. Mai precis, subtipul luminal A apare ca urmare a unei anomalii genetice produse într-un precursor bine diferenţiat [13,14] sau la nivelul unei celule luminale bine diferenţiate, RE+ [15]. Pentru subtipul luminal B există mai multe ipoteze. Acesta se dezvoltă fie pornind de la un precursor RE+ mai primitiv, ceea ce explică expresia mai redusă a RE şi prognosticul mai rezervat, comparativ cu subtipul luminal A [15], fie dintr-o celulă stem RE sau celule progenitor programate [50]. Subtipul luminal A CM subtip luminal A are un nivel foarte înalt de expresie a genelor RE activate şi a genelor asociate estrogenului (ESR1, GATA3, NAT1, FOXA1) şi un nivel scăzut de expresie a genelor implicate în proliferare [2]. Prin studii de hibridizare genomică comparativă (eng. Comparative Genomic Hybridisation - CGH), s-a demonstrat că este corelat cu o instabilitate genomică scăzută, prezentând o amplificare redusă a genelor definite [50,51]. Spre deosebire de subtipul luminal B, nu exprimă HER2/neu şi este caracterizat prin grad histologic scăzut, rată de proliferare redusă şi prognostic bun, fiind considerat un tip de CM mai puţin agresiv [11]. Profilul imunohistochimic al acestui subtip este RE+/RP+/Her2. Subtipul luminal B CM subtip luminal B exprimă suplimentar o serie de gene legate de proliferare şi de ciclul celular [2]. Prima secvenţă a mecanismului patogenic constă în modificare genetică prin amplificare la nivelul 8p11-p12, 8q21-q24 sau 20q13, urmată de proliferare şi diferenţiere [52]. Pe măsura creşterii potenţialului de proliferare, celulele acumulează noi amplificări, precum şi pierderea heterozigozităţii (eng. Loss of Heterozigozity LOH) în regiunile 1p şi 16q. Consecutiv, subtipul luminal B este corelat cu instabilitate genomică crescută [52]. Acest subtip prezintă grad histologic înalt, rată de proliferare înaltă şi un prognostic semnificativ mai rezervat decât tumorile luminale tip A [5,11,47-49,53]. Subtipul luminal B este Her2/neu+ şi deţine, surprinzător, câteva caracteristici de expresie similare tumorilor RE (de exemplu creşterea frecvenţei mutaţiilor TP53) [2]. Profilul imunohistochimic al acestui subtip este RE+/RP+/Her2+. 148
Subtipul luminal A versus subtipul luminal B Prin raportare la clasificarea histologică a CM, subtipul luminal (A şi B) are corespondenţă în majoritatea carcinoamelor ductale infiltrative bine diferenţiate (grad 1), uneori şi forme moderat diferenţiate (grad 2) şi nediferenţiate (grad 3) care exprimă RE şi/sau RP, precum şi în carcinoamele lobulare infiltrative, carcinoamele tubulare, cribriforme, coloide. Deoarece carcinoamele ductale invazive incluse în subtipul luminal A sunt extrem de diferite sub raportul gradului tumoral (de la 1 la 3), al nivelului de expresie al receptorilor hormonali şi al ratei de proliferare, se consideră că acest subtip molecular trebuie, în perspectivă, subclasificat [3]. Diferenţe între cele două subtipuri luminale sugerează că prognosticul în CM RE+ nu este determinat numai de prezenţa RE, ci şi de alţi factori de exemplu factorii de proliferare (indexul Ki-67 este redus pentru subtipul A, crescut pentru subtipul B [54], pierderea heterozigozităţii în poziţia RB1, frecventă în subtipul luminal B, extrem de rară în subtipul A [55]. Subtipul luminal C Noul subtip identificat, extrem de heterogen, are o evoluţie mai agresivă decât subtipurile luminal A sau B [6]. 5.2. Tumorile RE negative Din punctul de vedere al originii, cele mai multe studii susţin, pentru subtipul Her2 şi subtipul bazal-like, potenţialul de transformare malignă a unei celule stem mamare RE [13,14]. Există însă şi opinii diferite pentru subtipul bazal-like, care vor fi prezentate ulterior, în conexiune cu discuţiile legate de caracterizarea (dificilă) a acestuia. Subtipul HER2 pozitiv Tumorile HER2 sunt caracterizate printr-o serie de modificări genetice complexe, care implică creşterea expresiei genelor localizate în aceeaşi regiune a cromozomului 17q, anume gena pentru EGFR (ERBB2) şi proteina 7 de legare a receptorului factorului de creştere (eng. Growth Factor Receptor Bound Protein 7 GRB7) [2]. Au fost identificate, suplimentar, mutaţii ale genei tumorale supresor TP53 şi pierderea (foarte rar) heterozigozităţii în poziţia RB1 [2]. Supraexpresia proteinei HER2, ca rezultat al alterărilor în amplificarea ERBB2, este asociată cu grad histologic înalt, expresie scăzută a RE şi RP, uneori expresie crescută a receptorului androgenic (RA), şi prognostic negativ [56,57] prin metastare agresivă. Profilul imunohistochimic al acestui subtip este RE /RP /Her2+. Mecanismul patogenic prin care HER2 intervine în secvenţa carcinogenezei şi metastazării este însă nedefinit. Acest subtip este în mod particular rezistent la terapia endocrină, fapt care justifică tratamentul cu anticorp monoclonal recombinat, Trastuzumab (Herceptin), care creşte semnificativ supravieţuirea [58]. Prin raportare la clasificarea histologică, CM HER2+ corespunde predominant carcinomului ductal invaziv moderat diferenţiat (grad 2) şi nediferenţiat (grad 3) [59], precum şi carcinoamelor mamare apocrine [60,61]. Controverse asupra apartenenţei exclusive la tumorile RE negative; posibile subtipuri Subtipul HER2+, clasificat iniţial în categoria tumoria RE, nu este însă absolut omogen. La această concluzie s-a ajuns datorită faptului că amplificarea genei HER2, prezentă în peste 80% din CM HER2+, a fost decelată şi în 10-15% din cazurile de CM RE+ [48,62-64]. 149
Consecutiv, imunohistochimic au fost separate două subgrupe HER2+, unele RE, altele RE+, subgrupe pentru care este deschisă investigarea asupra modului în care HER2 poate determina comportamente clinice diferite [59]. Subgrupa HER2+/RE+ este asociată subtipului luminal B, motiv pentru care s-a propus denumirea de subtip bazoluminal [65]. De asemenea, în categoria altor posibile subtipuri moleculare a căror profil este parţial suprapus peste cele existente, şi parţial diferit, se discută despre grupul tumorilor moleculare apocrine. În baza potenţialului similar subtipului HER2, a prezenţei genelor pentru RA, a secvenţei patogenice în care intervine activarea semnalizării RA şi a caracteristicilor histologice de tip apocrin, studiile dedicate acestui grup pledează pentru individualizarea sa, ca entitate distincă în cadrul clasificării moleculare [66,67]. Profilul imunohistochimic al acestui posibil subtip este RE /RA+/Her2+. Subtipul bazal-like Subtipul bazal-like este denumit astfel datorită celulelor neoplazice care exprimă în mod evident gene prezente în celulele bazale/mioepiteliale normale ale sânului [7,68-74]. Acestea sunt: gene pentru citokeratine cu greutate moleculară înaltă (KRT5 citokeratina 5, KRT6 citokeratina 6, KRT14 citokeratina14, KRT17 citokeratina 17), pentru calponina 1 (CNN1), caveolina 1 şi 2 (CAV1), laminină (LAMB1), P- cadherine, nestine, vimentină, fascină, CD44, EGFR [2,42,43,70,75-78]. Tumorile bazal-like pot exprima însă şi caracteristicile genetice ale epiteliului luminal, inclusiv citokeratinele 8/18 (dar la un nivel mai scăzut decât în subtipul luminal), şi KIT, specific epiteliului luminal RE [2,79]. Au fost identificate, asociat, amplificarea genică a genei EGFR [49], aneusomie [80], modificări genomice (câştiguri în regiunile 12p13 şi 10p, pierderi în regiunile 4p şi 5q) [51,81], pierderea heterozigozităţii în poziţia RB1, mutaţii tip TP53 (în peste 85% din cazuri) şi BRCA1 [82,83], precum şi expresia crescută a genelor legate de proliferare [43,70]. Mutaţiile genei BRCA1 sunt dovezi clare în favoarea unor caracteristici comune CM ereditar şi CM sporadic bazal-like [3,84,85]. Carcinoamele basal-like au grad histologic înalt şi rată de proliferare înaltă. Prin raportare la clasificarea histologică, CM bazal-like include carcinoamele ductale invazive nediferenţiate (16-37% din total), cu grad 3 şi cu heterogenitate morfologică importantă (tip tubular solid/medular atipic, sau având o importantă zonă acelulară centrală), carcinoame medulare tipice, tumori având caracteristici medulare, carcinoame metaplazice de tipul carcinosarcoamelor [43,70,76,82,86-91]. Acest subtip are un prognostic rezervat datorită comportamentului clinic agresiv, cu supravieţuire fără evenimente recurente redusă şi supravieţuire generală mai scazută decât orice alt subtip al CM. Probleme majore sunt legate de alegerea terapiei, deoarece terapia endocrină şi/sau trastuzumabul sunt ineficiente datorită lipsei receptorilor RE, RP şi HER2/neu. Pentru subtipul bazal-like, profilul genic atât de complex face dificilă o caracterizare IHC având în vedere şi faptul că termenul generic triplu negativ se referă exclusiv la RE, RP şi HER2 (RE /RA /Her2 ), şi nu la expresia altor markeri [43]. Un subtip bazal-like propus [70] este definit prin secvenţa markerilor moleculari RE /HER2 /EGFR+ şi/sau CK5/6+, comună pentru 15-25% din totalul CM. Introducerea suplimentară în panel a altor citokeratine (de exemplu CK14), specifice celulelor bazale, a condus la identificare mai precisă a cazurilor, cu rezultat în scăderea procentului de tumori subtip bazal-like menţionat mai sus [75]. 150
Panelul IHC a fost recent completat prin alţi markeri mezenchimali şi mioepiteliali (EGFR, CD10, p63, P-caderină şi caveolină), a căror asociere oferă sensibilitate şi specificitate crescută în trasarea profilului molecular al subtipului bazallike [90]. Controverse asupra originii În cercetările axate pe stabilirea originii subtipului bazal-like, profilul genic identificat în celulele tumorale (prezentat anterior) a constituit un argument major pentru a susţine asocierea cu celulele bazale mioepiteliale. Această asociere este însă contestată printr-un studiu publicat în 2009 [92]. În baza rezultatelor obţinute, autorii susţin că în subtipul bazal-like dezvoltat în context sporadic, precum şi pentru CM ereditare (ambele entităţi patologice prezentând mutaţii ale genelor BRCA1) originea este reprezentată de celule precursoare tip luminal, şi nu de celule bazale. Consecutiv, în caracterizarea subtipului bazal-like în conformitate cu criteriile clasificării moleculare apar o multitudine de probleme, de la stabilirea unui acord în terminologia deja implementată la explicarea profilului genic şi molecular în contextul actual al datelor asupra orginii. Cu referire strictă la terminologie, există opinii care susţin că această (posibilă) origine diferită nu influenţează numele atribuit [93], şi opinii care consideră că termenul bazal-like trebuie obligatoriu înlocuit [4,3,7,49]. Subtipul normal-like Grupul neclasificabil, normal-like, definit iniţial după expresia asemănătoare ţesutului mamar normal şi tumorilor benigne [5,17], este încă slab caracterizat [2,53,81], iar unele studii contestă chiar existenţa sa [5,6,94]. Este posibil ca acest subtip să fie, în realitate, datorat unui artefact de prelevare/eşantionare, prin contaminarea probei cu o cantitate importantă de ţesut normal [48,95]. Alte subtipuri moleculare Recent, aprofundarea investigării genice şi IHC a CM RE a condus la identificarea unor profile diferite de cele existente, ceea ce deschide perspectivele completării clasificării moleculare. Conform fluxului principal de publicaţii, cercetările sunt orientate asupra descifrării semnificaţiei biologice şi clinice a trei noi subtipuri moleculare [2,6]: grupul apocrin (prezentat succint în cadrul subtipului Her2), grupul interferon (caracterizat prin expresia înaltă a genelor reglate de interferon (STAT1) [96] şi grupul claudin-low, desprins din categoria triplu-negativă, bazal-like (caracterizat prin expresia scăzută sau absentă a markerilor de diferenţiere luminală, prezenţa markerilor de tranziţie epitelio-mezenchimală, a genelor implicate în reglarea răspunsului imun şi a unor trăsături similare celulelor stem tumorale) [93]. 6. PERSPECTIVE Cercetările asupra CM realizate în ultimul deceniu urmăresc implementarea profilul expresiei genice ca şi standard de aur pentru evaluarea acestei patologii, translat într-un sistem taxonomic ideal, cu impact benefic în practica diagnostică şi terapeutică [6,95]. Până în momentul de faţă, însă, rezultatele sunt incomplet validate, existând numeroase neconcordanţe care pot fi explicate inclusiv prin utilizarea de gene intrinseci diferite, prin reproductibilitatea limitată a metodologiei sau a prevalenţei limitate a tipurilor histologice speciale. Consecutiv, se deschid direcţii de cercetare pentru aprofundarea acestui subiect, o caracterizare moleculară precisă oferind perspectiva unei abordări terapeutice individualizate. 151
NOTA Primul autor este doctorand in cadrul proiectului POSDRU/88/1.5/S/58965, Burse Doctorale pentru Doctoranzi Competitivi în Aria Europeană a Cercetării, lucrarea fiind rezultat al documentarii realizate in cadrul stagiului doctoral. BIBLIOGRAFIE 1. WHO. WHO fact sheet no 297. Geneva: World Health Organization; 2006. 2. McCafferty PJ, Healy NA, Kerin MJ. Breast cancer subtypes and molecular biomarkers. Diag Histopathol 2009; 15(10): 485-489. 3. Moinfar F. Is 'basal-like' carcinoma of the breast a distinct clinicopathological entity? A critical review with cautionary notes. Pathobiology 2008; 75(2): 119 131. 4. Gusterson B. Do basal-like breast cancers really exist? Nat Rev Cancer 2009; 9(2): 128-134. 5. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98(19): 10869-10874. 6. Hergueta-Redondo M, Palacios J, Cano A, Moreno-Bueno G. New molecular taxonomy in breast cancer. Clin Trans Oncol 2008; 10(2): 777-785. 7. Gusterson BA, Ross DT, Heath VJ, Stein T. Basal cytokeratins and their relationship to the cellular origin and functional classification of breast cancer. Breast Cancer Res 2005; 7(4): 143-148. 8. Liu S, Dontu G, Wicha MS. Mammary stem cells, self-renewal pathways, and carcinogenesis. Breast Cancer Res 2005; 7(3): 86 95. 9. Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, Morrison SJ, Clarke M.F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci 2003; 100(7): 3983-3988. 10. Stingl J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol 2009; 217(2): 229-241. 11. Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, Hastie T. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(14): 8418-8423. 12. Polyak K. Breast cancer: origins and evolution. J Clin Invest 2007; 117(11): 3155-3163. 13. Dontu G, El-Ashry D, Wicha MS. Breast cancer, stem/progenitor cells and the estrogen receptor.trends Endocrinol Metab 2004; 15(5): 193 197. 14. Behbod F, Rosen M. Will cancer stem cells provide new therapeutic targets? Carcinogenesis 2005; 26(4): 703-711. 15. Stingl J, Caldas C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer 2007; 7(10): 791-799. 16. Vargo-Gogola T, Rosen JM. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer 2007; 7(9): 659-672. 17. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000; 406(6797): 747 752. 18. Charafe-Jauffret E, Ginestier C, Monville F et al. Gene expression profiling of breast cell lines identifies potential new basal markers. Oncogene 2006; 25(15): 2273 2284. 19. Weigelt B, Hu Z, He X. Molecular portraits and 70-gene prognosis signature are preserved throughout the metastatic process of breast cancer. Cancer Res 2005; 65(20): 9155 9158. 20. van de Vijver MJ, He Y, van t Veer LJ et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002; 347(25): 1999 2009. 21. van t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415(6871): 530-536. 22. Wang Y, Klijn JGM, Sieuwerts AM et al. Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph node-negative primary breast cancer. Lancet 2005; 365(9460): 671 679. 23. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S et al. Gene expression profiling in breast cancer: understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis. J Natl Cancer Inst 2006; 98(4): 262-272. 24. Potti A, Dressman HK, Bild A et al. Genomic signatures to guide the use of chemotherapeutics. Nat Med 2006; 12(11): 1294-1300. 25. Straver ME, Glas AM, Hannemann J et al. The 70-gene signature as a response predictor for neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2010; 119(3): 551 558. 26. Knauer M, Mook S, Rutgers EJT et al. The predictive value of the 70-gene signature for adjuvant chemotherapy in early breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2010; 120(3): 655 661. 152
27. Buyse M, Loi S, van t Veer L et al. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node- negative breast cancer. J Natl Cancer Inst 2006; 98(17): 1183 1192. 28. Bender RA, Knauer M, Rutgers EJ. The 70-gene profile and chemotherapy benefit in 1600 breast cancer patients. J Clin Oncol 2009; 27: 512. 29. Foekens JA, Atkins D, Zhang Y et al. Multicenter validation of a gene expression based prognostic signature in lymph node negative primary breast cancer. J Clin Oncol 2006; 24(11): 1665 1671. 30. Ma XJ, Wang Z, Ryan PD et al. A two-gene expression ratio predicts clinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen. Cancer Cell 2004; 5(6): 607 616. 31. Jerevall PL, Brommesson S, Strand C et al. Exploring the two-gene ratio in breast cancerindependent roles for HOXB13 and IL 17BR in prediction of clinical outcome. Breast Cancer Res Treat 2008; 107(2): 225 234. 32. Goetz MP, Suman VJ, Ingle JN et al. A two-gene expression ratio of homeobox 13 and interleukin 17B receptor for prediction of recurrence and survival in women receiving adjuvant tamoxifen. Clin Cancer Res 2006; 12(7): 2080 2087. 33. Jansen MP, Siewerts AM, Look MP et al. HOXB13 to IL17BR expression ratio is related to tumor aggressiveness and response to tamoxifen of recurrent breast cancer: a retrospective study. J Clin Oncol 2007; 25(6): 662 668. 34. Cronin M, Pho M, Dutta D et al. Measurement of gene expression in archival paraffin embedded tissues: development and performance of a 92-gene reverse transcriptase polymerase chain reaction assay. Am J Pathol 2004; 164(1): 35 42. 35. Paik S, Shak S, Tang G et al. A multigene assay to predict recurrence of tamoxifen treated, nodenegative breast cancer. N Engl J Med 2004; 351(27): 2817 2826. 36. Habel LA, Shak S, Jacobs MK et al. A population-based study of tumor gene expression and risk of breast cancer death among lymph node-negative patients. Breast Cancer Res 2006; 8(3): 1 15. 37. Esteva FJ, Sahin AA, Cristofanilli M et al. Prognostic role of a multigene reverse transcriptase- PCR assay in patients with node-negative breast cancer not receiving adjuvant systemic therapy. Clin Cancer Res 2005; 11(9): 3315 3319. 38. Paik S, Tang G, Shak S et al. Gene expression and benefit of chemotherapy in women with node-negative, estrogen receptor- positive breast cancer. J Clin Oncol 2006; 24(23): 3726 3734. 39. Albain KS, Barlow WE, Shak S et al. Prognostic and predictive value of the 21- gene recurrence score assay in postmenopausal women with node-positive, oestrogen-receptor-positive breast cancer on chemotherapy: a retrospective analysis of a randomised trial. Lancet Oncol 2010; 11(1): 55 65. 40. Martin M, Palacios Gonzales F, Cortes J, Haba J et al. Prognostic and predictive factors and genetic analysis of early breast cancer. Clin Transl Oncol 2009; 11(10): 634-642. 41. Fan C, Oh DS, Wessels L et al. Concordance among gene-expression-based predictors for breast cancer. N Engl J Med 2006; 355(6): 560 569. 42. Hsu AL, Tang SL, Halgamuge SK. An unsupervised hierarchical dynamic self-organizing approach to cancer class discovery and marker gene identification in microarray data. Bioinformatics 2003; 19(16): 2131 2140. 43. Reis-Filho JS, Tutt AN. Triple negative tumours: a critical review. Histopathology 2008; 52(1): 108 118. 44. Cianfrocca M, Gradishar W. New Molecular Classifications of Breast Cancer. CA Cancer J Clin 2009; 59(5): 303-313. 45. Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up. Histopathology 2002; 41(3A): 403-410. 46. Ellis IO, Galea M, Broughton N et al. Pathological prognostic factors in breast cancer. II. Histological type. Relationship with survival in a large study with long-term follow-up. Histopathology 1992; 20(6): 479-489. 47. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000; 406(6797): 747-752. 48. Parker JS, Mullins M, Cheang MC et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes. J Clin Oncol 2009; 27(8): 1160-1167. 153
49. Weigelt B, Baehner FL, Reis-Filho JS. The contribution of gene expression profiling to breast cancer classification, prognostication and prediction: a retrospective of the last decade. J Pathol 2010; 220(2): 263-280. 50. Melchor L, Benítez J. An integrative hypothesis about the origin and development of sporadic and familial breast cancer subtypes. Carcinogenesis 2008; 29(8): 1475 1482. 51. Adélaïde J, Finetti P, Bekhouche I et al. Integrated profiling of basal and luminal breast cancers. Cancer Res 2007; 67(24): 11565 11575. 52. Adem C, Soderberg CL, Hafner K et al. ERBB2, TBX2, RPS6KB1, and MYC alterations in breast tissues of BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Genes Chromosomes Cancer 2004; 41(1): 1 11. 53. Correa Geyer F, Reis-Filho JS. Microarray-based gene expression profiling as a clinical tool for breast cancer management: are we there yet? Int J Surg Pathol 2009; 17(4): 285-302. 54. Cheang MC, Chia SK, Voduc D. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of patients with luminal B breast cancer. J Natl Cancer Inst 2009; 101(24): 736-750. 55. Herschkowitz JI, He X, Fan C, Perou CM. The functional loss of the retinoblastoma tumour suppressor is a common event in basal-like and luminal B breast carcinomas. Breast Cancer Res 2008; 10(5): R75. 56. Kaptain S, Tan LK, Chen B. Her-2/neu and breast cancer. Diagn Mol Pathol 2001; 10(3): 139-152. 57. Lal P, Tan LK, Chen B. Correlation of HER-2 status with estrogen and progesterone receptors and histologic features in 3,655 invasive breast carcinomas. Am J Clin Pathol 2005; 123(4): 541-546. 58. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005; 353(16): 1659-1672. 59. Vanden Bempt I, Drijkoningen M, De Wolf-Peeters C. The complexity of genotypic alterations underlying HER2-positive breast cancer: an explanation for its clinical heterogeneity. Curr Opin Oncol 2007; 19(6): 552 557. 60. Varga Z, Zhao J, Ohlschlegel C, Odermatt B, Heitz PU. Preferential HER-2/neu overexpression and/or amplification in aggressive histological subtypes of invasive breast cancer. Histopathology 2004; 44(4): 332 338. 61. Farmer P, Bonnefoi H, Becette V et al. Identification of molecular apocrine breast tumours by microarray analysis. Oncogene 2005; 24(29): 4660 4671. 62. Rouzier R, Perou CM, Symmans WF et al. Breast cancer molecular subtypes respond differently to preoperative chemotherapy. Clin Cancer Res 2005; 11(16): 5678-5685. 63. Ellis MJ, Tao Y, Young O et al. Estrogen-independent proliferation is present in estrogenreceptor HER2-positive primary breast cancer after neoadjuvant letrozole. J Clin Oncol 2006; 24(19): 3019 3025. 64. Marchiò C, Natrajan R, Shiu K et al. The genomic profile of HER2-amplified breast cancers: the influence of ER status. J Pathol 2008; 216(4): 399 407. 65. Laakso M, Tanner M, Nilsson J et al. Basoluminal carcinoma: a new biologically and prognostically distinct entity between basal and luminal breast cancer. Clin Cancer Res 2006; 12(14): 4185 4191. 66. Farmer P, Bonnefoi H, Becette V et al. Identification of molecular apocrine breast tumours by microarray analysis. Oncogene 2005; 24(29): 4660-4671. 67. Doane AS, Danso M, Lal P et al. An estrogen receptor-negative breast cancer subset characterized by a hormonally regulated transcriptional program and response to androgen. Oncogene 2006; 25(28): 3994-4008. 68. van de Rijn M, Perou CM, Tibshirani R. Expression of cytokeratins 17 and 5 identifies a group of breast carcinomas with poor clinical outcome. Am J Pathol 2002; 161(6): 1991-1996. 69. Abd El-Rehim DM, Pinder SE, Paish CE et al. Expression of luminal and basal cytokeratins in human breast carcinoma. J Pathol 2004; 203(2): 661-671. 70. Nielsen TO, Hsu FD, Jensen K et al. Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. Clin Cancer Res 2004; 10(16): 5367-5374. 71. Rakha EA, Putti TC, Abd El-Rehim et al. Morphological and immunophenotypic analysis of breast carcinomas with basal and myoepithelial differentiation. J Pathol 2006; 208(4): 495-506. 72. Turner NC, Reis-Filho JS. Basal-like breast cancer and the BRCA1 phenotype. Oncogene 2006; 25(43): 5846-5853. 154
73. Savage K, Lambros MB, Robertson D et al. Caveolin 1 is overexpressed and amplified in a subset of basal-like and metaplastic breast carcinomas: a morphologic, ultrastructural, immunohistochemical, and in situ hybridization analysis. Clin Cancer Res 2007; 13(1): 90-101. 74. Savage K, Leung S, Todd SK et al. Distribution and significance of caveolin 2 expression in normal breast and invasive breast cancer: an immunofluorescence and immunohistochemical analysis. Breast Cancer Res 2008; 110(2): 245-256. 75. Rakha EA, El-Syed ME, Green AR, Paish EC, Lee AH, Ellis IO. Breast carcinoma with basal differentiation: a proposal for pathology definition based on basal cytokeratin expression. Histopathology 2007; 50(4): 434 438. 76. Jacquemier J, Padovani L, Rabayrol L at al. Typical medullary breast carcinomas have a basal/myoepithelial phenotype. J Pathol 2005; 207(3): 260-268. 77. Parry S, Savage K, Marchio C, Reis-Filho JS. Nestin isexpressed in basal-like and triple negative breast cancers. J Clin Pathol 2008; 61(9): 1045-1050. 78. Klingbeil P, Natrajan R, Everitt G et al. CD44 is overexpressed in basal-like breast cancers but is not a driver of 11p13 amplification. Breast Cancer Res 2010; 120(1): 95-109. 79. Westbury CB, Reis-Filho JS, Dexter T, Mahler-Araujo B. Genome-wide transcriptomic profiling of microdissected human breast tissue reveals differential expression of KIT (c-kit, CD117) and oestrogen receptor-alpha (ER alpha) in response to therapeutic radiation. J Pathol 2009; 219(1): 131-140. 80. Gilbert JA, Goetz MP, Reynolds CA, Ingle JN. Molecular analysis of metaplastic breast carcinoma: high EGFR copy number via aneusomy. Mol Cancer 2008; 7(4): 944-951. 81. Pusztai L, Mazouni C, Anderson K et al. Molecular classification of breast cancer: limitations and potential. Oncologist 2006; 11(8):868 877. 82. Turner NC, Reis-Filho JS, Russell AM et al. BRCA1 dysfunction in sporadic basal-like breast cancer. Oncogene 2007; 26(14): 2126-2132. 83. Silver DP, Richardson AL, Eklund AC et al. Efficacy of neoadjuvant Cisplatin in triple-negative breast cancer. J Clin Oncol 2010; 28(7):1145-1153. 84. Lakhani SR, Reis-Filho JS, Fulford L, Penault-Llorca F. Prediction of BRCA1 status in patients with breast cancer using estrogen receptor and basal phenotype. Clin Cancer Res 2005; 11(14): 5175-5180. 85. Honrado E, Benítez J, Palacios J. The molecular pathology of hereditary breast cancer: genetic testing and therapeutic implications. Mod Pathol 2005; 18(10): 1305 1320. 86. Fulford LG, Easton DF, Reis-Filho JS, Sofronis A. Specific morphological features predictive for the basal phenotype in grade 3 invasive ductal carcinoma of breast. Histopathology 2006; 49(1): 22-34. 87. Livasy CA, Karaca G, Nanda R et al. Phenotypic evaluation of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. Mod Pathol 2006; 19(2): 264-271. 88. Reis-Filho JS, Milanezi F, Steele D et al. Metaplastic breast carcinomas arebasal-like tumours. Histopathology 2006; 49(1): 10-21. 89. Rodríguez-Pinilla SM, Rodríguez-Gil Y, Moreno-Bueno G et al. Sporadic invasive breast carcinomas with medullary features display a basallike phenotype: an immunohistochemical and gene amplification study. Am J Surg Pathol 2007; 31(4): 501 508. 90. Sarrió D, Rodriguez-Pinilla SM, Hardisson D, Cano A, Moreno-Bueno G, Palacios J. Epithelialmesenchymal transition in breast cancer relates to the basal-like phenotype. Cancer Res 2008; 68(4): 989 997. 91. Sasaki Y, Tsuda H. Clinicopathological characteristics of triple-negative breast cancers. Breast Cancer 2009; 16(4): 254 259. 92. Lim E, Vaillant F, Wu D et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nat Med 2009; 15(8): 907-913. 93. Prat A, Perou CM. Mammary development meets cancer genomics. Nat Med 2009; 15(8): 842-844. 94. Gruvberger S, Ringner M, Chen Y et al. Estrogen receptor status in breast cancer is associated with remarkably distinct gene expression patterns. Cancer Res 2001; 61(16): 5979-5984. 95. Peppercorn J, Perou CM, Carey LA. Molecular subtypes in breast cancer evaluation and management: divide and conquer. Cancer Invest 2008; 26(1): 1-10. 96. Hu Z, Fan C, Oh DS et al. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms. BMC Genomics 2006; 7: 96. 155