REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Abordări diagnostice neinvazive în cadrul patologiei aparatului dento-maxilar Doctorand Iulia Clara Kimmel (căs. Badea) Co

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Abordări diagnostice neinvazive în cadrul patologiei aparatului dento-maxilar Doctorand Iulia Clara Kimmel (căs. Badea) Conducător de doctorat Prof. Dr. Floarea Fildan Cluj-Napoca 2015

CUPRINS INTRODUCERE 15 STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 19 1. Glandele salivare. Anatomie, patologie și fiziologie 21 1.1. Anatomia glandelor salivare 21 1.1.1. Cadru general 21 1.1.2. Glanda parotidă 21 1.1.3. Glanda submandibulară 21 1.1.4. Glanda sublinguală 22 1.2. Patologia difuză a glandelor salivare 22 1.2.1. Litiaza salivară 22 1.2.2. Patologia salivară de iradiație 23 1.2.3. Sindromul Sjogren 24 1.2.4. Boala Mikulicz 24 1.3. Fiziologia glandelor salivare 24 1.3.1. Compoziția salivei 24 1.3.2. Modificări ale compoziției salivare în patologiile glandelor salivare 25 1.3.3. Volumul, fluxul și ph-ul salivar 26 1.3.4. Funcțiile salivei 26 1.3.5. Sialometrie. Metode de recoltare a salivei totale 27 1.3.6 Valoarea diagnostică a salivei 29 2. Evaluarea neinvazivă a glandelor salivare 31 2.1. Anamneza și examenul clinic 31 2.2. Radilogia convențională 31 2.3. Computertomografia 32 2.4. Rezonanța magnetică nucleară (RMN) 32 2.5. Tomografia computerizată cu emisie de pozitroni (PETCT) 32 2.6. Sialografia 33 2.7. Ultrasonografia 33 3. Ultrasonografia 35 3.1. Cadru general 35 3.2. Ultrasonografia normală a glandelor salivare 35 3.3. Patologie 36 3.3.1. Tumorile glandelor salivare 36 3.3.2. Mase cervicale non neoplazice 37

3.4. Explorara ultrasonografică a rigidității tisulare. Elastografia 38 3.4.1. Cadru general 38 3.4.2. Tehnici de ultrasonografie elastografică 39 3.4.2.1. Elastografia prin vibrație de suprafață cu frecvență joasă 39 3.4.2.2. Elastografia statică 39 3.4.2.3. Elastografia bazată pe forța de iradiere a undelor acustice 39 CONTRIBUŢIA PERSONALĂ 43 1. Ipoteza de lucru/obiective 45 2. Studiul 1 Evaluarea elastografică cantitativă Acoustic Radiation Force Impulse a morfologiei glandelor parotide 47 2.1. Introducere 47 2.2. Ipoteza de lucru/obiective 48 2.3. Material şi metodă 48 2.4. Rezultate 51 2.5. Discuţii 52 2.6. Concluzii 56 3. Studiul 2 Evaluarea cantitativă a mușchiului maseter utilizând Acoustic Radiation Force Impulse 57 3.1. Introducere 57 3.2. Ipoteza de lucru/obiective 58 3.3. Material şi metodă 58 3.4. Rezultate 60 3.5. Discuţii 61 3.6. Concluzii 63 4. Studiul 3. Utilizarea metodei UPLC-QTOF-ESI (+) MS și a spectrometriei de masă cu injectarea directă (DIMS) pentru determinarea profilului metabolomic al salivei de repaus și stimulate 65 4.1. Introducere 65 4.2. Ipoteza de lucru/obiective 66 4.3. Material şi metodă 66 4.4. Rezultate 68 4.5. Discuții 72 4.6. Concluzii 73

5. Studiul 4. Caracterizarea profilului metabolic al salivei nestimulate şi stimulate folosind analiza spectrometrică în Infraroșu cu Transformantă Fourier, asistatǎ de Analiza Componentelor Principale 75 5.1. Introducere 75 5.2. Ipoteza de lucru/obiective 76 5.3. Material şi metodă 77 5.4. Rezultate 78 5.5. Discuții 81 5.6. Concluzii 83 6. Concluzii generale 85 7. Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei 87 REFERINȚE 89

INTRODUCERE Prin definiție, o manoperă diagnostică poate fi considerată neinvazivă atunci când, pentru a evalua starea fiziologică sau patologică a organismului uman nu este necesară funcționarea tegumentului sau abordarea cavităților naturale ale corpului [1]. În practica medicală de specialitate, procesul diagnostic presupune o anamneză focusată și un examen clinic amănunțit, ce se realizează prin metode diagnostice neinvazive precum inspecția, percuția și auscultația. În situațiile în care în urma examenului clinic, datele furnizate nu sunt suficiente pentru a formula un diagnostic precis, se impune implementarea metodelor diagnostice complementare. Similar cu utilizarea stetoscopului ca metodă neinvazivă în cadrul examenului clinic, se poate utiliza o metodă neinvazivă, respectiv metoda ultrasonografică, pentru a furniza imagini a diferitelor țesuturi și organe din regiunea oro-maxilo-facială. Dacă până în prezent, pentru determinarea stării fiziologice și fiziopatologice a organismului, sunt necesare analize de sânge ce presupun funcționarea tegumentului, în momentul de față se prefigurează potențialul unor noi medii de diagnostic neinvaziv, precum saliva. Cercetarea doctorală prezentă are drept scop implementarea unor metode diagnostice imagistice neinvazive, moderne, pentru a investiga diferitele patologii ale aparatului dento-maxilar, în special efectele radioterapiei asupra mușchiului maseter și asupra glandelor salivare, precum și de a pune bazele stabilirii testării metabolomice salivare ca metodă de diagnostic. Patologia aparatului dento-maxilar (mușchii masticatori, glandele salivare) constituie un beneficiar direct al metodelor de diagnostic imagistic, datorită accesabilității zonelor de interes prin localizarea lor superficială. Prima dată când s-a raportat utilizarea ultrasonografiei pentru studiul glandelor salivare a fost în anul 1971 de către Bozin și colab. [2]. Această tehnică imagistică este capabilă să furnizeze date anatomice (conturul formațiunilor, diametrele, raporturile cu structurile învecinate), precum și date morfologice (omogenitatea parenchimului, ecogenitatea, etc.). Dintre toate metodele imagistice, am ales ca procedură de cercetare elastografia, tehnică ce prezintă mare interes pentru cercetători. Elastografia oferă clinicianului și cercetătorului posibilitatea de a traduce informația furnizată de către cel mai puțin dezvoltat simț al nostru (simțul tactil) în informație coerentă ce aparține celui mai dezvoltat simț al nostru (văzul). De asemenea, elastografia, spre deosebire de alte tehnici imagistice, oferă cifre, deci oferă evaluarea cantitativă a țesutului sau organului studiat [3]. Cercetarea clinică conține două studii ce au ca numitor comun explorarea imagistică elastografică a modificărilor anatomice și structurale induse de către

radioterapia cervicală la nivelul mușchiului maseter și a glandelor salivare parotide. În timpul practicii clinice efectuate în cadrul catedrei de Prevenție în Medicina Dentară, unde efectuând teste salivare la diferiți pacienți, am devenit sensibilizată la starea de xerostomie avansată prezentă la pacienții care au fost supuși radioterapiei pentru diferite afecțiuni oncologice. Acest fapt a ridicat problema afectării structurale a glandelor salivare postradioterapie și a dus la elaborarea studiului de cercetare. În acest sens, am folosit tehnica elastografică Acoustic Radiation Force Impulse (ARFI) pentru a evalua, pe un lot de pacienți, gradul de elasticitate al parenchimului glandular parotidian consecutive radioterapiei. Această cercetare se dorește a contribui la studiul explorării elastografice a glandelor salivare. Rezultatele studiului oferă un protocol de examinare ARFI, descrierea valorilor undelor de forfecare pentru parenchimul glandular sănătos, cât și pentru parenchimul glandular afectat de radioterapie. Urmând un protocol asemănător, s-a realizat studiul asupra mușchiului maseter sănătos și a mușchiului maseter postradioterapie. În cea de-a doua jumătate a secolului XX a apărut pentru prima dată ideea de a utiliza saliva ca mediu de diagnostic. Saliva reprezintă un fluid accesibil, care poate fi colectat foarte ușor și atraumatic de către pacient. Prin folosirea salivei ca mediu de diagnostic, devine posibilă depistarea timpurie a anumitor patologii și monitorizarea evoluției patologiei în relație cu tratamentul administrat [4, 5]. Cercetarea fundamentală se bazează pe două studii ce implementează diferite modalități de testare metabolomică a salivei, cu scopul de a stabili amprenta salivară a unui subiect sănătos, respectiv o hartă metabolomică salivară, care să stea la baza unor viitoare cercetări de identificare a unor biomarkeri salivari pentru diferite patologii (ex: cancer oral, afecțiuni parodontale, sindrom Sjogren, etc.). În esență, această teză de doctorat își dorește să stabilească importanța și necesitatea dezvoltării și utilizării în practica medicală curentă a noilor metode de diagnostic, precum diagnosticul salivar ca și metodă diagnostică neinvazivă, cu posibilitatea de a fi folosită în viitor ca metodă facilă de screening pentru întreaga populație, precum și ultrasonografia, metodă ce permite o evaluare neinvazivă a anumitor afecțiuni. Prezentul studiu este finanțat prin proiectul de burse doctorale POSDRU nr. 107/h1.5/S/78702. Cuvinte cheie: Glanda patoridă, mușchiul maseter, elastografie, metabolomică, saliva stimulată și de repaus.

Ipoteza de lucru CONTRIBUȚIA PERSONALĂ Cercetarea doctorală a plecat de la ideea implementării diferitelor tehnici diagnostice neinvazive, precum explorarea ultrasonografică convențională 2D, ecografia Doppler, elastografia ARFI și testarea metabolomică salivară în practica clinică medicală pentru patologia aparatului dento-maxilar. Obiectivele cercetării: 1. Evaluarea performanțelor ultrasonografiei și a tehnicii elastografice ARFI, o tehnică diagnostică modernă ce permite evaluarea cantitativă a elasticității unui țesut, în relație cu patologia glandelor salivare și a mușchiului maseter postradioterapie. 2. Evaluarea performanțelor a două tehnici de screening și anume tehnica cu randament ridicat UPLC-QTOF-ESI (+) MS și spectrometria de masă cu injecție directă (DIMS) în evidențierea biomarkerilor metabolici în saliva de repaus și cea stimulată. 3. Aplicarea spectrometriei în infraroșu FT-MIR-ATR pentru a evalua comparativ amprentele salivei pacienților, cu scopul indentificării posibililor biomarkeri care discriminează între saliva nestimulată și saliva stimulată. Studiul I. Evaluarea elastografică cantitativă Acoustic Radiation Force Impulse a morfologiei glandelor parotide Scopul studiului. Determinarea valorii diagnostice a elastografiei ARFI (Acoustic Radiation Force Impulse) în evaluarea rigidității parenchimului glandei parotide normale și a glandei parotide postradioterapie. Material și metodă. Studiu s-a desfășurat prospectiv în perioada februariemartie 2012, fiind centrat pe glandele salivare parotide. S-au examinat un număr de 60 de glande parotide normale aparținând la 30 de voluntari sănătoși și 40 de glande salivare cu patologie difuză postiradiere, aparținând la 20 de pacienți care au fost supuși radioterapiei pentru diferite afecțiuni oncologice ale regiunii oro-maxilofaciale. Subiecții au fost supuși examinării ultrasonografice în modul B, fiind determinat volumul glandular. S-a efectuat o examinare elastografică ARFI și au fost determinate vitezele undelor de forfecare pentru centrul și periferia parenchimului glandular, rezultatele fiind exprimate în m/s.

Rezultate. Media volumului glandular în cadrul grupului de voluntari sănătoși a fost de 12,02±0,6 cm 3, semnificativ mai ridicată decât în cadrul grupului de pacienți ce au fost supuși radioterapiei, care a fost 10,3±0,74 cm 3 (p<0,0001). Valorile normale ale vitezelor undelor de forfecare au fost similare la glanda parotidă dreaptă și stângă, anume 1,52-1,54 m/s (p=0,15). În cadrul grupului de pacienți supuși radioterapiei, rigiditatea tisulară este semnificativ crescută, comparativ cu rigiditatea glandelor salivare la subiecții sănătoși, având valori ale vitezelor undelor de forfecare de 1,72 m/s (p=0,0002). Concluzii. Valorile vitezelor undelor de forfecare sunt similare pentru glanda parotidă stângă și dreaptă în cazul subiecților sănătoși (1,52-1,54 m/s). În cadrul grupului de subiecți postradioterapie, elasticitatea parenchimului glandular este semnificativ mai ridicată (1,72 m/s). Explorarea ARFI a glandelor parotide constituie o tehnică ce permite cuantificarea elasticității glandulare, atât pentru glandele normale cât și pentru glandele cu patologie difuză postiradiere. Studiul II. Evaluarea cantitativă a mușchiului maseter utilizând Acoustic Radiation Force Impulse (ARFI) Introducere. Elasticitatea țesuturilor este influențată de către procesele fiziologice și patologice. Sono-elastografia este o tehnică relativ recent introdusă, care permite evaluarea elasticității tisulare, iar metoda ARFI prezintă avantajul măsurării vitezelor de propagare a undelor de forfecare. Prezentul studiu își propune evaluarea elasticității mușchiului maseter la un lot de subiecți sănătoși și la un lot de pacienți supuși radioterapiei pentru patologie oncologică la nivelul capului și gâtului. Material și metodă. Studiul a inclus 25 de pacienți sănătoși (lotul A) cu vârsta de 25,6+/-8,4 ani; (B:F=9:16). Treisprezece pacienți care au fost supuși radioterapiei (minim 35 Gy) pentru malignități ale capului și gâtului au constituit Lotul B (vârstă 50+/-11,93 ani; B:F=9:4). Examinarea ARFI s-a realizat bilateral, în periferia (P) și centrul mușchiului (C), în stare de relaxare și ulterior în stare de contracție, obținându-se media și deviația standard (M+/-SD). Rezultate. Pentru lotul A, valorile ARFI în stare relaxare în dreapta au fost: C=1,87+/-0,52m/s, P=1,96+/-0,55 m/s, iar în stânga au fost :C=1,66+/-0,47m/s, P=1,67+/-0,53 m/s. În cadrul lotului B în stare relaxare, în dreapta valorile ARFI au fost: C=1,67+/-0,6 m/s, P 1,72+/-0,56 m/s, iar în stânga au fost: C=1,6+/-0,34 m/s, P=1,73+/-0,37 m/s. Nu au existat diferențe semnificative statistic (p>0,05) între periferie și centru atât la pacienții lotului A cât și lotului B, indiferent de partea investigată sau de starea de relaxare respectiv contracție. Valorile înregistrate pentru relaxare și contracție la lotul A, respectiv B (obținute prin concatenarea

valorilor din dreapta și stânga) nu au prezentat diferențe semnificative (1,79+/-0,52 m/s vs. 1,72 +/-0,73 m/s, p=0,72 și 1,70+/-0,48 m/s, vs 1,59+/-0,77 m/s, p=0,98). Mediile tuturor măsurătorilor lotului A față de lotul B nu au fost semnificative statistic ( 1,79+/-0,52 m/s vs. 1,65+/-0,63 m/s, p=0,78). Concluzii. Elastografia ARFI cu cuantificarea SWV permite determinarea elasticității normale și postiradiere a mușchilor maseteri. Valoarea diagnostică a metodei este susținută de obiectivitatea crescută. Studii suplimentare pe loturi extinse de pacienți sunt necesare pentru validarea valorilor normale și a celor asociate afectărilor patologice particulare. Studiul III. Utilizarea metodei UPLC-QTOF-ESI (+) MS și a spectrometriei de masă cu injectare directă (DIMS) pentru determinarea profilului metabolomic al salivei de repaus și stimulate Introducere. Tehnica cu randament ridicat UPLC-QTOF-ESI (+) MS a fost aplicată în paralel cu spectrometria de masă cu injecție directă (DIMS) pentru a obține profilul metabolomic al salivei stimulate și nestimulate. Material și metodă. Au fost selectați aleator, un număr de 12 voluntari sănătoși (femei și barbați), iar saliva lor a fost colectată înainte și după stimularea prin mestecare cu parafină. S-au înregistrat cromatograme ale extractelor metanolice din salivă (BPC), au fost identificate principalele semnale și datele MS (valorile m/z) au fost utilizate pentru a identifica biomarkerii metabolomici specifici. Analizele biostatistice efectuate prin Analiza Componentelor Principale au putut discrimina deosebirile de compoziție dintre probe. Rezultate. Amprentările comparative UPLC-QTOF-ESI (+) MS, înainte și după depozitarea la -20ºC, au arătat date similare cu analizele DIMS, dar cu cea din urmă s-a identificat o gamă mai largă de molecule, fără o separare preliminară prin cromatografie UPLC. Au fost identificați aproximativ 10 biomarkeri majori în principal derivați fosfolipidici, prezentând diferențe cantitative între saliva de repaus și cea stimulată. Concluzii. Considerând obiectivele și rezultatele acestor experimente, putem concluziona faptul că amprentarea metabolomică a salivei de repaus faţă de saliva stimulată poate fi obținută rapid și reproductibil, putând face posibilă identificarea biomarkerilor principali, care pot fi confirmați şi în baza de date Human Metabolomic Databases. Aceste rezultate preliminare vor fi utilizate pentru diagnosticarea precoce și monitorizarea efectelor terapiilor utilizate în patologia stomatologică precum și patologia sistemică.

Studiul IV. Caracterizarea profilului metabolomic al salivei nestimulate şi stimulate folosind analiza spectrometrică în Infraroșu cu Transformantă Fourier, asistatǎ de Analiza Componentelor Principale Introducere. Scopul acestui studiu a fost aplicarea spectrometriei în infraroșu FT-MIR-ATR pentru a evalua comparativ amprentele salivei pacienților, cu scopul indentificării posibililor biomarkeri care discriminează între saliva nestimulată și saliva stimulată (ca indicator de stres). Material și metodă. A fost aplicatǎ metoda spectrometricǎ în Infraroșu cu Transformantǎ Fourier şi Reflecție Atenuatǎ (FTIR-MIR-ATR), pentru a obține profilul metabolomic specific şi biomarkerii de discriminare biostatistică (prin metoda PCA - Principal Component Analysis) a 12 perechi de probe de salivǎ de repaus (nestimulatǎ) şi salivǎ stimulatǎ, obţinute de la voluntari sǎnǎtoşi. Probele de salivă nestimulată au fost colectate înainte de mâncare, în timp ce probele de salivǎ stimulatǎ au fost colectate dupǎ stimulare cu parafină. Probele au fost conservate în azida de Na 1%, deproteinizate cu metanol, înainte de analizǎ. Spectrele au fost comparate calitativ prin identificarea regiunilor principale de absorbţie și cantitativ, prin mǎsurarea suprafeţei semnalelor (peak-urilor) pentru fiecare grup de probe de salivǎ. Analiza Componentelor Principale (PCR) a fost realizatǎ prin discriminarea diferenţelor dintre probe, fie bazatǎ pe FTIR brut sau al celei de-a doua derivatǎ a spectrului. Rezultate. Regiunea 1000-1700 cm -1 a corespuns absorbţiilor specifice ale glucidelor. Absorbţiile specifice proteinelor/peptidelor/aminoacizilor au avut intensitate mai mare pentru saliva stimulatǎ în contrast cu saliva nestimulatǎ (probe 1-8), în timp ce probele 9-12 au arătat intensități similare sau chiar mai scǎzute dupǎ stimulare. În regiunea 2000-2200 cm -1, corespunzătoare absorbției azidelor, tiocianațiilor și lipidelor, au fost remarcate intensități mai mari pentru saliva stimulată (1-4 și 7) contrar probelor de saliva nestimulată, în timp ce probele 5,6,8,9-12 au arătat intensități similare sau chiar mai scăzute dupa stimulare. Probele de salivă stimulată au fost grupate similar și asociate în regiunea intermediară între PC-1 pozitiv PC-2 neutru, cu dominanţa componentei PC-2, în timp ce saliva nestimulată a fost reprezentată de PC-1 pozitiv. Concluzii. În consecinţă, aspectul și informațiile oferite de spectrele FTMIR au permis evidenţierea diferenţelor de compoziţie metabolomică între probele de salivă nestimulată și stimulată.

CONCLUZII GENERALE Explorarea elastografică ARFI a glandelor salivare parotide reprezintă o metodă obiectivă, cantitativă de evaluare a elasticității parenchimului glandular, atât în cazul glandelor normale, cât și în cazul glandelor cu patologie difuză postiradiere. Valorile vitezelor undelor de forfecare determinate prin tehnica elastografică ARFI, corespunzătoare unei rigidități normale, sunt similare la cele două glande salivare dreapta/stânga la subiecții sănătoși și anume 1,52-1,54 m/s. În cazul pacienților supuși la radioterapie, valorile vitezelor undelor de forfecare sunt semnificativ mai ridicate, corespunzând unei rigidități tisulare crescute, cu valori medii de 1,72 m/s. Examinarea prin tehnica ARFI a mușchiului maseter reprezintă o metodă obiectivă de a cuantifica elasticitatea musculară în cazul subiecților sănătoși, cât și în cazul pacienților ce au fost supuși radioterapiei în regiunea oro-maxilo-facială. Valorile vitezelor undelor de forfecare măsurate prin tehnica ARFI ce corespund unei rigidități musculare normale sunt similare la cei doi mușchi maseter stânga/dreapta și anume 1,79 m/s. În cazul pacienților supuși radioterapiei, valorile vitezelor undelor de forfecare sunt ușor scăzute, nesemnificativ statistic, cu valori medii de 1,65 m/s. Aplicând în paralel tehnica UPLC-QTOF-ESI (+) și tehnica spectrometriei de masă cu injectatre directă (DIMS) pentru a realiza o amprentă metabolomică a salivei stimulate și a salivei nestimulate, a fost posibilă identificarea biomarkerilor salivari principali. Tehnica DIMS permite, fără separare preliminară, identificarea în detaliu a metaboliților cu masă moleculară mică. Cele două metode de analiză au relevat în special diferențe de ordin calitativ mai mult decât cantitativ între probele de salivă. Analiza ATR-FT-MIR a salivei s-a dovedit o metodă eficientă și rapidă pentru a identifica biomarkeri salivari specifici ce pot indica atât calitatea salivei, cât și efectele unor condiții de stres la nivel celular și molecular asupra salivei. Aplicând tehnici asistate de biostatistică pe spectrul direct FT-MIR sau pe a doua derivată a fost posibilă discriminarea între saliva stimulată și nestimulată. ORIGINALITATEA ȘI CONTRIBUȚIILE INOVATIVE ALE TEZEI Prezentul studiu este centrat pe aplicațiile diferitelor metode de diagnostic neinvaziv în cadrul patologiei aparatului dento-maxilar. Elementele de originalitate sunt: a. evaluarea elastografiei ARFI în stări normale și patologice difuze ale

glandei parotide. În cadrul cercetării sunt stabilite valorile normale ale vitezelor undelor de forfecare și este demonstrată utilitatea metodei în documentarea fibrozării parenchimului glandular, indusă de procesul de radioterapie în regiunea oro-maxilo-facială. b. evaluarea elastografiei ARFI a elasticității mușchiului maseter normal și a mușchiului maseter postradioterapie. În cadrul cercetării sunt stabilite valorile normale ale vitezelor undelor de forfecare și este demonstrată utilitatea metodei în documentarea fibrozării mușchiului maseter, indusă de procesul de radioterapie în regiunea oro-maxilo-facială. c. aplicarea în paralel a două tehnici performante (UPLC-QTOF-ESI (+) MS și injectare directă (DIMS) relevă faptul că amprentarea metabolomică a salivei de repaus faţă de saliva stimulată poate fi obținută rapid și reproductibil, putând face posibilă identificarea biomarkerilor principali, care pot fi confirmați şi în baza de date Human Metabolomic Databases. Aceste investigații pot avea o relevanță bună pentru utilizarea salivei ca fluid pentru diagnostic şi pentru aplicații clinice și pot deschide perspectiva identificării și validării biomarkerilor salivei pentru boli sistemice. d. analiza ATR-FT-MIR a salivei s-a dovedit a fi un instrument eficient, neinvaziv pentru screening-ul și identificarea biomarkerilor specifici, care pot indica calitatea salivei și efectele unor condiţii de stres la nivel celular și molecular. REFERINȚE 1. Mosby's Medical Dictionary, 8th edition [internet]. Elsevier. 2009. Noninvasive.[cited 2014 Dec 18]. Available from: http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/noninvasive. 2. Bozin YN, Romancheva EM. Biolocation diagnosis of diseases of parotid and submaxilar salivary glands. Stomatologia. 1971; 50:27. 3. Dudea SM. Has ultrasound elastography come to the age of ripening?. Med Ultrason. 2014; 16(2):87-88. DOI:10.11152/mu.2013.2066.162.smd1. 4. Richard P, Jiri S, Jana V, et al. Saliva as a diagnostic medium. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2009; 153(2):103-10. 5. Voss HF. Saliva as a fluid for measurement of estriol levels. Am J Obstet Gynecol. 1999; 180:S226-31.

PhD THESIS SUMMARY Noninvasive diagnostic approaches in the pathology of the dento-maxillary system PhD Student Iulia Clara Kimmel (căs. Badea) PhD Advisor Prof. Dr. Floarea Fildan Cluj-Napoca 2015

CONTENTS INTRODUCTION 15 THE CURRENT STATE OF KNOWLEDGE 19 1. Salivary glands. Anatomy, pathology and physiology 21 1.1. Anatomy of the salivary glands 21 1.1.1. General aspects 21 1.1.2. Parotid gland 21 1.1.3. Submandibular gland 21 1.1.4. Sublingual gland 22 1.2. Diffuse pathology of the salivary glands 22 1.2.1. Sialolithiasis 22 1.2.2. Salivary gland damage after radiation therapy 23 1.2.3. Sjogren Syndrome 24 1.2.4. Mikulicz disease 24 1.3. Salivary gland physiology 24 1.3.1. Saliva composition 24 1.3.2. Changes of the saliva composition in different salivary gland pathologies 25 1.3.3. Volume, flow rate and salivary ph 26 1.3.4. The functions of saliva 26 1.3.5. Sialometry. Sample collection of whole saliva 27 1.3.6 The diagnostic value of saliva 29 2. Evaluarea neinvazivă a glandelor salivare 31 2.1. Anamnesis and clinical examination 31 2.2. Conventional radiology 31 2.3. Computer tomography 32 2.4. Magnetic resonance imaging (MRI) 32 2.5. Positron emission tomography computed tomography (PETCT) 32 2.6. Sialography 33 2.7. Ultrasonography 33 3. Ultrasonografia 35 3.1. General aspects 35 3.2. Ultrasonography of the normal salivary glands 35 3.3. Pathology 36 3.3.1. Salivary gland tumors 36

3.3.2. Nonneoplastic neck masses 37 3.4. Ultrasonographic exploration of tissue stiffness. Elastography 38 3.4.1. General aspects 38 3.4.2. Elastographic techniques 39 3.4.2.1. Elastography by low frequency surface vibration 39 3.4.2.2. Static Elastography 39 3.4.2.3. Shear Wave Elastography 39 PERSONAL CONTRIBUTION 43 1. Working Hypothesis/Objectives 45 2. Study I Quantitative elastografic ARFI evaluation of the morphology of the parotid glands. 47 2.1. Introduction 47 2.2. Working Hypothesis/Objectives 48 2.3. Material and methods 48 2.4. Results 51 2.5. Discussion 52 2.6. Conclusion 56 3. Study II Quantitative assessment of the masseter muscle s elasticity using Acoustic Radiation Force Impulse 57 3.1. Introduction 57 3.2. Working Hypothesis/Objectives 58 3.3. Material and methods 58 3.4. Results 60 3.5. Discussion 61 3.6. Conclusion 63 4. Study III. UPLC-QTOF-ESI(+) MS and direct MS injection used to fingerprint resting and stimulated saliva profiles. 65 4.1. Introduction 65 4.2. Working Hypothesis/Objectives 66 4.3. Material and methods 66 4.4. Results 68 4.5. Discussion 72 4.6. Conclusion 73

5. Study IV - Metabolomics approach to characterize resting versus stimulated saliva using Middle-Infrared Spectroscopy fingerprint assisted by Principal Component Analysis 75 5.1. Introduction 75 5.2. Working Hypothesis/Objectives 76 5.3. Material and methods 77 5.4. Results 78 5.5. Discussion 81 5.6. Conclusion 83 6. General conclusions 85 7. Originality and innovative contributions of the thesis 87 REFERENCES 89

INTRODUCTION By its definition, a diagnostic procedure may be considered noninvasive when for the evaluation of the physiological or pathological state of the human body, the puncturing of the skin or the accessing of the natural cavities of the body is not necessary [1]. In the clinical practice, the diagnostic process involves a focused anamnesis and a thorough clinical examination, which is achieved through noninvasive diagnostic methods such as inspection, percussion and auscultation. When after the clinical examination, the data available is not sufficient in order to give an accurate diagnosis the implementation of complementary diagnostic methods becomes necessary. In the same way we use the stethoscope as a noninvasive method during he clinical examination, we may use the ultrasound examination technique in order to provide images of the different tissues and organs in the oro-maxillofacial region. If until recently, for determining the physiological and physiopathological state of the human body, blood analysis was needed, which involved puncturing the skin, then at this moment the diagnostic potential of a new noninvasive diagnostic medium (saliva) is being outlined. The present PhD research aims to implement certain modern, noninvasive imaging diagnostic methods for the investigation of the different pathologies of the dento-maxillary system, especially the effects of radiotherapy on the masseter muscle and the salivary glands. Furthermore, the research aims to establish the metabolomics saliva testing as a reliable diagnostic method. The dento-maxillary system pathology (masseter muscle, parotid gland) is a direct beneficiary of the ultrasound diagnostic method because of the accessibility of the region of interest that is situated superficially. The first use of the ultrasound technique, for the study of the salivary glands, was reported in 1971 by Bozin et al. [2]. This imaging technique is able to provide anatomical data (contour of the mass, diameters, the relation to the surrounding structures) as well as morphological data (homogeneity of the parenchyma, echogenicity). Out of all the existing imaging techniques, I elected Elastography as a research procedure, a technique that is of great interest for researchers. Elastography offers the clinician and the researcher the opportunity to translate the information given by our least developed sense (sense of touch) into coherent information, which pertains to our most developed sense (sight). Furthermore, elastography, as opposed to other imaging techniques, offers numbers, in order words it offers a quantitative evaluation of the tissue or organ studied [3]. The clinical research includes two studies that have as a common

denominator the elastographic exploration of the morphological and anatomical changes of the masseter muscle and the parotid gland induced by radiation of the head and neck region. During the clinical practice performed at the Department of Prevention in Dental medicine, while performing saliva tests for different patients, I was sensitized to the advanced xerostomia that patients who underwent radiation therapy of the head and neck area presented. This fact raised the issue of the structural damage brought to the salivary glands by radiation therapy and led to the elaboration of the present research. In this respect, I used the elastographic Acoustic Radiation Force Impulse (ARFI) technique to evaluate, on a group of patients, the elasticity of the parotid gland parenchyma after radiation therapy. This research aims to contribute to the elastographic exploration of the salivary glands. The results of this study offer an ARFI examination protocol, the normal values of the shear waves velocities for the normal glandular parenchyma, as well as the values of the shear waves velocities for the glandular parenchyma after radiotherapy. Following a similar protocol, a study of the healthy and the post radiotherapy masseter muscle was conducted. The ideea of using saliva as a diagnostic medium appeared for the first time in the second half of the XX th century. Saliva represents an accessible fluid, that can be collected easily and nontraumatic by the patient. By using saliva as a diagnostic medium, the early detection of certain pathologies and the monitorisation of the patologies in relation to the treatment given becomes possible [4, 5]. The fundamental research includes two studies that implement different metabololomic saliva testing techniques, with the aim of establishing the salivary fingerprint of a healty subject, a salivary metabolomic map, that will be the foundation of future studies for the identification of salivary biomarkers for different pathologies (eg. oral cancer, periodontal disease, Sjogren Sindrome). In essence, this PhD thesis aims to establish the importance and the necesity of developping and using in the current medical practice new diagnostic methods such as the salivary diagnosis as a noninvasive diagnostic method, with the possibility of using it in the future as an easy screening method for the entire population, as well as ultrasonography, a method that enables a noninvasive evaluation of certain pathologies. The present study was carried out with the financial support of POSDRU PhD scholarship project No. 107/h1.5/S/78702. Prezentul studiu este finanțat prin proiectul de burse doctorale POSDRU nr. 107/h1.5/S/78702. Key words: Parotid gland, masseter muscle, Elastography, Metabolomics, Stimulated and resting saliva.

PERSONAL CONTRIBUTION Working hypothesis The doctoral research started from the idea of implementing various noninvasive diagnostic techniques such as conventional 2D ultrasonography, Doppler ultrasonography, ARFI elastography and metabolomics saliva testing in the clinical medical practice concerning different pathologies of the dento-maxillary system. Research Objectives: 1. The performance assessment of ultrasonography and ARFI elastography, a modern diagnostic technique that enables the quantitative evaluation of a tissue s elasticity in relation to salivary gland and masseter muscle post radiotherapy pathology. 2. The performance assessment of two screening techniques such as the high throughput techniques UPLC-QTOF-ESI (+) MS and direct injection mass spectrometry (DIMS) in highlighting the metabolic biomarkers in the rested and stimulated saliva. 3. Application of infrared spectroscopy FT-MIR-ATR for the comparative evaluation of saliva fingerprints, with the aim of identifying possible biomarkers that can discriminate between resting and stimulated saliva. Study I. Quantitative elastographic ARFI evaluation of the morphology of the parotid glands Purpose. The aim of this study is to determine the diagnostic value of the Acoustic Force Radiation Impulse Imaging (ARFI) elastography technique in assessing the stiffness of glandular parenchyma of the normal and the postirradiation parotid gland. Material and methods. The study was developed between February and March 2012 the main focus of the study being the salivary parotid glands. 60 normal parotid glands pertaining to 30 healthy volunteers and 40 pathological parotid glands pertaining to 20 patients who underwent radiation therapy for different head and neck malignancies were included in this study. The patients underwent a B mode ultrasonographic examination and the volume of the parotid gland was determined. A subsequent ARFI examination was performed and the shear wave velocities (SWV) were determined for the central and the periphery of the glandular parenchyma, the results being expressed in m/s.

Results. The mean volume of the glands in the volunteers group was 12.02±0.6 cm 3, significantly lower than in the group of patients who underwent radiation therapy, which was 10.3±0.74 cm 3 (p<0.0001). The normal values of the SWV were similar between the left and right PG, measuring 1.52-1.54 m/s (p=0.15). In the radiation therapy group the stiffness is significantly higher, with SWV values of 1.72 m/s (p=0.0002). Conclusion. The normal values of the SWV were similar between the left and right PG, measuring 1.52-1.54 m/s. In the radiation therapy group the stiffness is significantly higher, with SWV values of 1.72 m/s. The evaluation of the parotid glands with ARFI constitutes an objective technique for the determination of glandular stiffness, both in normal glands and diffuse pathologies. Study II. Quantitative assessment of the masseter muscle s elasticity using Acoustic Radiation Force Impulse Purpose. This study proposes to assess the masseter elasticity in the healthy population and for a group of patients who underwent radiation therapy for cancer entities in the head and neck. Material and methods. The study included 25 healthy patients (group A) aged 25.6 + / -8.4 years; (M: F = 9:16). Thirteen patients who underwent radiotherapy (35 Gy minimum) for head and neck malignancies formed group B (age 50 + / -11.93 years, M: F = 9:4). The ARFI examination was performed bilaterally in the periphery (P) and the centre of the muscle (C), during relaxation and subsequent contraction, able to obtain the mean values and the standard deviation (M + /-SD). Results. For group A, the values during relaxation for the right muscle were C = 1.87 + / -0.52 m / s and L = 1.96 + / -0.55 m / s and the left C = 1.66 + / - 0.47 m / s, P = 1.67 + / -0.53 m / s In group B the relaxation right C = 1.67 + / -0.6 m / s, P 1.72 + / -0.56 m / s, and the left C = 1.6 + / -0, 34 m / s, P = 1.73 + / -0.37 m / s. There were no statistically significant differences (p> 0.05) between the periphery and the centre of both group A and group B, regardless of the state of relaxation or contraction investigated. The values recorded for relaxation and contraction in group A and B (obtained by concatenating the values of the right and left) showed no significant differences (1.79 + / -0.52 m / s vs. 1.72 + / -0.73 m / s, p = 0.72 and 1.70 + / -0.48 m / s and vs. 1.59 + / -0.77 m / s, p = 0.98). The mean values of all measurements for group A compared to group B were not statistically significant (1.79 + / -0.52 m / s vs. 1.65 + / -0.63 m / s, p = 0.78).

Conclusions. The ARFI elastography with SWV enables the quantification of normal and post irradiation elasticity of the masseter muscles. The diagnostic value of the method is supported by the high objectivity of the method. Further studies are needed on large groups of patients to validate the normal values and those associated with specific pathologies. Study III. UPLC-QTOF-ESI(+) MS and direct MS injection used to fingerprint resting and stimulated saliva profiles. Purpose. A rapid and reliable profiling of resting and stimulated saliva by two high throughput techniques, LC-QTOF-ESI (+) MS and direct injection mass spectrometry (DIMS) was performed. Material and methods. Male and female healthy volunteers (n=12) were randomly selected, their resting, and stimulated saliva being collected, before and after chewing stimulation with parafin. Base peak chromatograms of saliva methanolic extracts (BPC) were recorded, the main peaks were identifed and the MS data (m/z values) were used to identify specific biomarkers. The biostatistic analysis made by Principal Component Analysis was applied to discriminate between samples profile. Results. The comparative UPLC-QTOF-ESI (+) MS fingerprints, before and after storage at -20ºC showed similar data with DIMS analysis, but the later one identified a larger range of molecules, without a preliminary separation by UPLC. Around 10 major biomarkers were identified, mainly phospholipid derivatives, showing quantitative differences among the resting and stimulated saliva. Conclusion. Considering the objectives and the results of these experiments, we can conclude that metabolomic fingerprinting of resting versus stimulated saliva can be achieved fast and in a reliable manner, supporting the identification of main biomarkers, which can be confirmed the Human Metabolomic Databases. Such preliminary results will be used for early diagnosis and monitoring therapy s effects in dental pathology as well as in systemic pathology. Study IV. Metabolomics approach to characterize resting versus stimulated saliva using Middle-Infrared Spectroscopy fingerprint assisted by Principal Component Analysis Introduction. The aim of this study was to apply Fourier Transform Mid- Infrared-ATR spectroscopy to evaluate comparatively the fingerprint of patients saliva, in order to identify possible biomarkers, which discriminate among resting,

non-stimulated saliva versus stimulated saliva (as a stress indicator). Material and methods. Fourier Transform Mid-Infrared spectroscopy with Attenuated Reflection combined with multivariate data Principal Component Analysis have been applied for the discrimination of 12 couples of resting and stimulated saliva obtained from healthy volunteers. The resting saliva samples were collected before eating, while stimulated saliva, after chewing stimulation with parafin and preserved in Natrium azide 1%, deproteinized by methanol, before analysis. The spectra were compared by identifying the main absorption regions and quantitatively, by measuring the area peaks for each group of saliva samples. The Principal Component Analysis was performed discriminate differences among samples, either based on raw FTIR or second derivative spectra. Results. The region 1000-1700 cm -1 corresponded to specific absorptions of saccharides and aminoacids/peptides/proteins where higher intensities for stimulated saliva against resting saliva (samples 1-8) while samples 9-12 showed similar or even decreased intensities after stimulation. In the region 2000 to 2200 cm -1, corresponding to specific absorptions of azides, thiocynates and lipids, there were noticed higher intensities for stimulated saliva (1-4 and 7) against resting saliva samples, while samples 5,6,8, 9-12 showed similar or even decreased intensities after stimulation. The stimulated saliva were grouped similarly and clustered in an intermediate region, between positive PC-1 and neutral PC-2 region, being more represented by a stronger PC-2 component, while resting saliva was represented by a positive PC-1. Conclusion. FTMIR spectra are able to discriminate between the composition differences between resting and stimulated saliva samples. Further studies are needed to discriminate better among the characteristics of physiological and pathological saliva samples. GENERAL CONCLUSIONS The ARFI elastographic exploration of the parotid salivary glands represents an objective, quantitative method of evaluation of the glandular parenchyma s elasticity, both in the case of normal salivary glands as well as salivary glands that are affected by a diffuse post radiation therapy pathology. The values of the shear waves velocities determined through this technique that correspond to a normal rigidity are similar for both glands, namely 1.52-1.54 m/s. In the case of the patients who underwent radiation therapy, the values of the shear waves velocities are significantly higher, corresponding to higher tissue stiffness, with mean values of

1,72 m/s. The ARFI examination of the masseter muscle represents an objective method of quantifying the muscles elasticity in the case of healthy subjects as well as in the case of patients that underwent radiation therapy in the oro-maxillofacial region. The values of the shear waves velocities, measured through the ARFI technique, that correspond to the normal muscle stiffness, are similar for the two right/left masseter muscles, namely 1.79 m/s. In the case of the patients that underwent radiation therapy, the values of the shear wave velocities are slightly lowered, not statistically significant, with mean values of 1.65 m/s. Applying, in a parallel manner, the two techniques UPLC-QTOF-ESI (+) and the direct injection mass spectrometry technique (DIMS), in order to elaborate a metabolomic fingerprint of the stimulated and resting saliva, has made possible the identification of the principal salivary biomarkers. The DIMS technique enables, without a preliminary separation, the detailed identification of metabolites with low molecular mass. These two methods revealed especially the qualitative more than the quantitative differences between the saliva samples. The ATR-FT-MIR analysis of the saliva proved to be an efficient and fast method of identification of the specific salivary biomarkers that can indicate both the quality of saliva as well as the effects of stress at cellular and molecular level on saliva. Applying assisted biostatistics techniques directly on the FT-MIR spectrum or on the second derivate, the discrimination between stimulated and rested saliva has been made possible. ORIGINALITY AND INNOVATIVE CONTRIBUTIONS OF THE THESIS The present study is centered on the applications of different noninvasive diagnostic methods in the field of dento-maxillary system pathology. The original elements are: a. ARFI elastographic evaluation of the normal parotid glands and the diffuse pathology of the parotid glands. This research establishes the normal values of the shear wave velocities and the usefulness of the method in documenting the level of fibrosis of the glandular parenchyma induced by radiation therapy applied on the oro-maxillofacial region is demonstrated. b. The ARFI elastographic evaluation of the masseter muscle s elasticity both in a healthy state as well as after radiation therapy. This research establishes the normal values of the shear waves velocities and proves the usefulness of

this method in documenting the level of fibrosis present in the masseter muscle due to radiation therapy of the oro-maxillofacial region. c. Applying in parallel two efficient techniques (UPLC-QTOF-ESI (+) MS and direct injection mass spectrometry (DIMS)) emphasysis the fact that the metabolomic fingerprinting of resting and stimulated saliva can be obtained in a fast and reproductible manner. These techniques enable the identification of the main salivary biomarkers that can be confirmed as well in the Human Metabolomic Databases. These investigations may have a great relevance for the future use of saliva as a diagnostic medium and for clinical aplications. They may open the perspective of identifying and validating saliva biomarkers for different sistemic diseases. d. The ATR-FT-MIR analysis of saliva proved to be an efficient, noninvasive instrument for screening and identifying specific biomarkers that can indicate the quality of the saliva as well as the effects of stress conditions on a cellular and mollecular level. REFERENCES 1. Mosby's Medical Dictionary, 8th edition [internet]. Elsevier. 2009. Noninvasive.[cited 2014 Dec 18]. Available from: http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/noninvasive. 2. Bozin YN, Romancheva EM. Biolocation diagnosis of diseases of parotid and submaxilar salivary glands. Stomatologia. 1971; 50:27. 3. Dudea SM. Has ultrasound elastography come to the age of ripening?. Med Ultrason. 2014; 16(2):87-88. DOI:10.11152/mu.2013.2066.162.smd1. 4. Richard P, Jiri S, Jana V, et al. Saliva as a diagnostic medium. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2009; 153(2):103-10. 5. Voss HF. Saliva as a fluid for measurement of estriol levels. Am J Obstet Gynecol. 1999; 180:S226-31.