Donatorul de grefă Eligibilitate, Compatibilitate HLA Monica Dutescu, Ruxandra Caisan Oradea, Noiembrie 2012
Genetica sistemului HLA Complexul Major de Histocompatibilitate (MHC) ansamblul de gene care codifică molecule HLA ( human leucocyte antigens ) exprimate pe membrana celulară = antigenele HLA cel mai polimorfic sistem uman gene de histocompatibilitate -pe braţul scurt al cromozomului 6
Genetica sistemului HLA MHC uman de clasa I - codifică pentru moleculele HLA-A, HLA-B, HLA-C. Aceste gene de clasa I codifică glicoproteinele exprimate pe suprafaţa celulelor nucleate, principala funcţie fiind prezentarea peptidelor antigenice celulelor Tc(CD8+) MHC uman de clasa II - codifică pentru moleculele HLA-DR, DQ, DP, in principal pentru glicoproteinele exprimate pe celulele prezentatoare de antigen, unde prezinta peptidele antigenice celulelor Th(CD4+) MHC uman de clasa III codifică diferite proteine cu funcţii imune incluzând componente ale sistemului complement si molecule implicate in inflamaţie.
Caracteristicile Sistemului HLA Polimorfismul - este determinat de numărul mare de alele existente pentru fiecare dintre genele sistemului HLA - Diversitatea alelelor existente pentru fiecare locus, operaţional separate - Excluderea reciproca a alelelor în timpul meiozei Numarul de alele HLA ( 2010) A B C ------ ------ ------ 1102 (24) 1724(49) 747(9) E F G ------ ------ ------ 9 21 46 DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 ------ ------ ------ ------ ------ ------ 3 891(20) 35 110(7) 28 139
Codominanţa Caracteristicile Sistemului HLA - Fiecare alelă de pe fiecare cromozom se exprimă fenotipic la suprafaţa celulei - Produşii pot fi detectaţi utilizând tehnici adecvate - Un individ are doi cromozomi 6 ->pentru fiecare locus vor exista 2 alele, câte una pentru fiecare cromozom - Homozigot = moşteneste două alele parentale identice pentru acelaşi locus - Heterozigot = moşteneste două alele parentale diferite pentru acelaşi locus = produşi prezenţi şi identificabili pe suprafaţa celulei - Excepţii de la a regula a codominanţei - alele nule sau silenţioase
Caracteristicile Sistemului HLA Segregarea şi transmiterea în bloc- fiecare individ posedă maxim 2 alele pentru acelaşi locus: una maternă şi una paternă. -alelele de pe un cromozom=haplotip se transmite in bloc -totalitatea antigenelor exprimate la suprafata celulelor unui individ=fenotip -Alele moştenite de la ambii parinti formează genotipul = 2 haplotipuri -copiii semiidentici cu parintii -3 combinatii intre frati: -25% HLA identici -25% HLA diferiti -50 % HLA semiidentici Transmiterea haplotipurilor într-o familie PĂRINŢI A1 B8 Cw7 DR3 DQ5 a c A1 B57 Cw6 DR7 DQ2 A2 B18 Cw3 DR4 DQ7 b d A11 B55 Cw3 DR6 DQ4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ COPII 1 2 3 4 A1B8Cw7DR3DQ5 A1B8Cw7DR3DQ5 A2B18Cw3DR4DQ7 A2B18Cw3DR4DQ7 A1B57Cw6DR7DQ2 A11B57Cw3DR6DQ4 A1B57Cw6DR7DQ2 A11B55Cw3DR6DQ4 a a b b c d c d
Caracteristicile Sistemului HLA Recombinarea - excepţii de la transmiterea în bloc, prin haplotipuri, a specificităţilor HLA - în cursul diviziunii meiotice pot surveni recombinări între cromozomii omologi Recombinare într-o familie - recombinarea a avut loc între locusul A şi locusul B PĂRINŢI A1 B8 A2 B51 A24 B35 A2 B51 COPII A2 B51 A1 B8 A24 B35 A1/B51 A2 B51 A2 B51 A2 B51 A1 B8 A24 B35 A24 B35
Caracteristicile Sistemului HLA Dezechilibrul de legare - Asociaţii genetice preferenţiale intre alelele de pe diferiţi loci ai aceluiasi cromozom =>> apariţia, într-o populaţie luată la întâmplare, a unor haplotipuri cu o frecvenţă semnificativ mai mare decât cea aşteptată dacă s-ar lua în consideraţie frecvenţa fiecarei alele luată separat în populaţia respectivă - Haplotipuri frecvente : A1 B8 Cw7 DR3 ; B35 Cw4 - Haplotipuri rare : A1 B7 ; A2 B8 se întâlnesc neaşteptat de rar - Grupa populaţională, regiunea geografică şi de procentul de recombinări * Caucazieni A1 B8 Cw7 DR3 ; A3 B7 Cw7 DR2 * Orientul Mijlociu : A26 B8 DR3; A30 B13 * Africa de Sud: A33 B14
Nomenclatura Sistemului HLA In uz din 1 aprilie 2010 human leucocyte Testat delimitare Substitutie Expresie antigen ADN silentioasa HLA - A * 02 : 01 : 01 : 02 L Locus / Grupa Subtip Diferente in afara Gena alelica regiunii codante Grupa alelica corespunde antigenului serologic sau familiei de alele Expresia L = Low N = Null S = secretor Q = Questionable
TEHNICI DE LUCRU PENTRU STABILIREA SPECIFICITATILOR HLA Tehnica serologica - de microlimfocitotoxicitate (Terasaki) = Determinarea antigenelor HLA de pe suprafaţa limfocitelor se face prin incubarea acestora cu o baterie de antiseruri în prezenţa complementului Prezenţa antigenului corespunzător antiserului -> produce reacţia antigen-anticorp - > adăugarea complementului - > de activarea - > permeabilizarea membranei celulare
TEHNICI DE LUCRU PENTRU STABILIREA SPECIFICITATILOR HLA Tehnici de biologie moleculară PCR-SSO / PCR-SSO inversată (Sequence Specific Oligoprobes) = amplificarea unei regiuni a ADN-ului genomic care prezintă un polimorfism care interesează PCR-SSP (Sequence Specific Primers) = amplificarea porneşte de la primeri - secvenţe oligonucleotidie cu rol declanşator - localizaţi în regiunile polimorfe = permite amplificarea specifică şi individuală a fiecărei alele / grup de alele PCR-SBT (Sequence Based Typing) = secvenţarea directă a regiunii polimorfe a genei HLA în vederea unui tipaj de înaltă rezoluţie
STABILIREA SPECIFICITATILOR HLA Niel de rezolutie al tipizarii HLA 2 digits - ex : HLA-A*02 - tipaj recrutare donatori / cautare initiala in familie 4 digits - ex : HLA-A*02:01 - tipaj la selectie
Compatibilitatea HLA Compatibilitate / match = potrivire perfecta intre alele HLA Incompatibilitate / missmatch = una sau mai multe alele diferite HLA- A,A / B,B; C,C; DRB1,DRB1; DQB1,DQB1 10 / 10 9 / 10 HLA- A,A; B,B; C,C; DRB1,DRB1 8 / 8 7 / 8 HLA- A,A; B,B; DRB1,DRB1-6 / 6 4 / 6 Element important pentru evolutia unei grefe Selectarea donatorului cel mai compatibil = donatorul ale carui celule determina un raspuns imun minim sau deloc la primitor, dupa transplantare
Protocolul pentru testarea HLA in vederea allotransplantului de celule stem hematopoietice Standardele Federatiei Europene de Imunogenetica (EFI) 1. Tipizare initiala : pacient si toate rudele de gradul I (frati, parinti) biologie moleculara - HLA-A, B, DRB1-2 digits 2. Tipizare extinsa - Daca exista un donator potential in familie frate identic 2 digits a. Transmiterea haplotipurilor este clara ->pacient + donator - probe noi de sange HLA-A,B,C,DRB1,DQB1 2digits/4digits b. Transmiterea haplotipurilor nu este clara, parinti netestati, homozigotie -> pacient + donator - probe noi de sange HLA-A,B,C,DRB1,DQB1-4 digits - Nu exista un donator potential in familie -> pacient - probe noi de sange HLA-A,B,C,DRB1,DQB1-4 digits 3. Tipizarea de verificare probe de sange pre-transplant -> HLA-A, B, DRB1-2 digits
Testarea HLA a donatorilor voluntari de celule stem hematopoietice Standardele Federatiei Europene de Imunogenetica (EFI) 1.Tipizare initiala donator nou biologie moleculara - minim HLA-A, B, DRB1-2 digits - aditional HLA-C HLA-A*02 Avantaj HLA-C: identificare mai rapida si eficienta a unui donator dorit Ex: perechi HLA-A,B,DRB1 match - excludere la tipajul extins = 67% perechi HLA-A,B,C, DRB1 match - excludere la tipajul extins = 19% 2. Tipizare extinsa - donator potential cuompatibil din registru - biologie moleculara HLA-A,B,C,DRB1,DQB1-4 digits HLA-A*02:01 a. Probe sange/ ADN conservate b. probe noi de sange 3. Tipizarea de verificare probe noi pre-transplant - minim HLA-A, B, DRB1-2 digits
Selectarea unui donator neînrudit de CSH Rolul compatibilităţii HLA Locus HLA Inclus in strategia de cautare Compatibilitate Rezolutie A Da Da 4 digits B Da Da 4 digits C Da Da 4 digits DRB1 Da Da 4 digits DRB3,4,5 Da Necunoscut DQB1 Da Neclar DPB1 Nu Neclar DQA1/DPA1 Nu Nu
Selectarea unui donator neînrudit de CSH Rolul compatibilităţii HLA Nu există diferenţe semnificative între incompatibilitaţile alelice, 4 Digits şi cele antigenice, 2 digits locusurile A,B,DRB1 Locus C incompatibilităţile antigenice sunt mai dăunatoare decât cele alelice Incompatibilităţile intra-creg nu sunt acceptabile Incompatibilităţile B si C sunt mai puţin daunatoare decât cele pentru A si DRB1 Incompatibilităţile DQB1 sunt cel mai bine tolerate Incompatibilităţile HLA-DPB1 pot determina o creştere a incidenţei GVHD sau a recăderilor după TX 10/10 Incompatibilităţi cu risc crescut 4 HLA-A ; 1 HLA-B ; 7 HLA-C ; 1 HLA-DRB1 ; 1 HLA DPB1 ; 1 HLA-DRB1/DQB1 >necesită studii pe un număr mare de cazuri
Selectarea unui donator neînrudit de CSH Rolul compatibilităţii HLA Populaţia caucaziană Donator adult A, B, C, DRB1 8 / 8 75% A, B, C, DRB1 7 / 8 92% CBU A, B, DRB1 6 / 6 40% A, B, C, DRB1 7 / 8 92%
Efectul unui singur miss-match pe un locus HLA asupra supravieţuirii JMDP NMDP NMDP FHCRC Japan Marrow Donor Program NAtional Marrow Donor Program NAtional Marrow Donor Program Fred Hutchinson Cancer Research Program Locus BM BM PBC BM A = = B = = = C = DRB1 = = = DQB1 = = = =
Selectarea unui donator neînrudit de CSH Factori non- HLA P / D P D Sex Vârstă Greutate Status CMV Diagnostic Regim de condiţionare Interval Dr.-Tx Sursa CSH - MO/Perif Tip donor Adult/CBU Gene non-hla
Selectarea unui donator neînrudit de CSH Strategia de căutare / selecţie Nivelul de compatibilitate este în funcție de pacient / boală Unii pacienţi / unele boli se pot tolera mai bine / mai multe incompatibilităţi Exista factori genetici şi non-genetici care influenţează aceste diferenţe Nu există un algoritm fix de cautare adaptat fiecarui caz