ACADEMIA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI SILVICE GHEORGHE IONESCU ŞIŞEŞTI BUCUREŞTI STAȚIUNEA DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU CREȘTEREA BOVINELOR ARAD Proiect ADER 5.2.4. Obţinerea, consolidarea şi bioconservarea unui nucleu de vaci de rasă Brună provenit pe linie paternă din tauri genotipaţi pentru genele implicate în sinteza K cazeinei din lapte Raport tehnic de fază Faza II: Stabilirea taurilor care vor fi utilizați în studiu [01.12.2015 30.04.2016] Coordonator proiect: Staţiunea de Cercetare Dezvoltare pentru Creşterea Bovinelor Arad Director proiect, Dr. Ing. Ilie Daniela Elena Proiect finanțat prin Planului sectorial pentru cercetare dezvoltare din domeniul agricol s i de dezvoltare rurala al Ministerului Agriculturii s i Dezvolta rii Rurale, pe anii 2015 2018, Agricultura s i Dezvoltare Rurala ADER 2020 Obiectivul proiectului: Ameliorarea genetică a unui efectiv de vaci de rasă Brună pentru calitatea producţiei de lapte prin utilizarea selecţiei asistate de markeri moleculari pentru genele implicate în sinteza lactoproteinelor. Rezultate preconizate pentru atingerea obiectivului: Genotiparea animalelor de rasă Brună pentru genele de importanţă economică implicate în sinteza proteinelor din lapte şi crearea de animale performante prin aplicarea unui sistem de selecţie asistată de markeri moleculari: crearea unei linii de vaci de Brună cu aptitudini superioare pentru calitatea laptelui (calitate superioară a proteinei, cu un conţinut crescut de k cazeină şi raportul proteină grăsime foarte strâns); Creşterea frecvenţei alelei favorabile B şi a genotipurilor favorabile BB şi AB pentru k cazeină şi β lactoglobulină; Îmbunătăţirea calităţii laptelui prin creşterea cantităţii de proteină şi grăsime din lapte. 1
Obiectivul fazei: Stabilirea taurilor de rasă Brună care vor fi utilizați în studiu în funcție devaloareade ameliorare și de genotipul obținut în urma efectuării analizei PCR RFLP. Activităţi preconizate pentru atingerea obiectivului fazei: 1. Achiziția de material seminal congelat (MSC) provenit de la tauri de rasă Brună; 2. Izolarea ADN genomic total din MSC; 3. Genotipareataurilor potențialigenitoripentrumarkerii molecularide interes; 4. Stabilirea taurilor care vor fi utilizați în studiu, în funcție de genotip și valoarea de ameliorare. Activitatea 1: Achiziția de material seminal congelat (MSC) provenit de la tauri de rasă Brună Taurii de rasă Brună incluși în testele de genotipare au fost aleși din cadrul centrelor SEMTEST dar și a companiilor specializate cu distribuirea de material seminal congelat din Romînia. Astfel, pentru testare au fost aleși următorii tauri: HEGALL 53498; VAG = 120; VAL = 125; clasa Eurotop HIPSIT 53571; VAG = 114; VAL = 107 HUPSI 51932; VAG = 119; VAL = 114 MOLOG 52875; VAG = 109; VAL = 111 WISCONSIN 54048; VAG = 105; VAL = 108 AMIGO 51937; VAG = 118; VAL = 120 HOUSTON 53795; VAG = 117; VAL = 112 MOBIL 53516; VAG = 110; VAL = 116 JUSIT 52806; VAG = 111; VAL = 107 PROLOG 52805; VAG = 107; VAL = 105 2
Activitatea 2: Izolarea ADN genomic total din MSC Pentru izolarea și purificarea ADN din material seminal congelat s a utilizat o metodă clasică de extracție. Principiul metodei a constat în liza celulelor seminale timp de minim6oreîntampondeliză,precipitarea proteinelor cu o soluţie de NaCl 6M şi extracţia ADN genomic total prin precipitare cu izopropanol și etanol 70%, urmatăde rehidratarea ADN. Puritatea probelor de ADN extrase a fost apreciată prin tehnică de spectofotometrie pe baza raportului A 260 /A 280 iar concentraţia probelor a fost calculată automat cu softwareul spectofotometrului NanoDrop 2000 Graficul spectrelor de absorbanță pentru probele de ADN Activitatea 2: Izolarea ADN genomic total din MSC Rezultatele obținute în urma determinării purităţii şi concentraţiei ADN prin tehnica de spectofotometrie 3
Activitatea 3: Genotiparea taurilor potențiali genitori pentru markerii moleculari de interes Amplificarea in situ a fragmentelor de ADN, specifice genelor de interes, prin intermediul tehnicii PCR Pentru genele de interes luate în studiu, s au amplificat următoarele sectoare de ADN : 1) κ cazeina (κ CN) 2) β lactoglobulina (β LG) 3) α lactalbumina(α La) Vizualizarea ampliconilor în gel de agaroză Rezultatele amplificării genelor de interes prin tehnica PCR 4
Restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză Restricţia produşilor de amplificare cu endonucleaze specifice, cu ajutorul tehnicii RFLP şi vizualizarea fragmentelor de restricţie de lungimi diferite, utilizând tehnica de electroforeză în gel de agaroză 5
Stabilirea taurilor care vor fi utilizați în studiu, în funcție de genotip și valoarea de ameliorare Stabilirea taurilor care vor fi utilizați în studiu, în funcție de genotip și valoarea de ameliorare 6
Stabilirea taurilor care vor fi utilizați în studiu, în funcție de genotip și valoarea de ameliorare În urma evaluărilor aptitudinilor de ameliorare în raport cu grupa de caractere de interes au fost incluși în studiu taurii Hegall (Ro 53498) și Hipsit (Ro 53571). Rezultate (cf. Planului de realizare al proiectului): Colectarea de material seminal congelat provenit de la tauri de rasă Brună de la unitățile SEMTEST din țară. Extracția de ADN genomic total din material seminal congelat provenit de la tauri de rasă Brună. Genotiparea taurilor de rasă Brună pentru genele implicate în sinteza proteinelor din lapte: κ cazeină, β lactoglobulină și α lactalbumină. Stabilirea taurilor care vor fi utilizați în studiu, în funcție de genotip și valoarea de ameliorare. Livrabile catre finantator: Raport tehnic de fază 7
Echipa proiectului Director proiect: Dr. Ing. Ilie Daniela Elena CSII Director SCDCB Arad: Dr. Ec. Săplăcan Gheorghe CSIII Drd. Ing. Neamț Radu CSIII Drd. Ing. Neciu Florin CSIII Ing. Costin Liviu CS Florin Marinescu tehnician 8