Explorarea potentialului speleoterapeutic prin tehnici de biologie celulara si moleculara Constantin Munteanu,, Iuri Simionca, Diana Munteanu, Mihai Hoteteu Institutul Naţional de Recuperare, Medicină Fizică şi Balneoclimatologie atologie Asociatia Romana de Balneologie
Institutul Naţional de Recuperare, Medicină Fizică şi Balneoclimatologie atologie DEPARTAMENT FIZIOLOGIE EXPERIMENTALA LABORATOR CULTURI CELULARE
Speleoterapia utilizeazã anumite condiţii specifice peşterilor şi salinelor pentru a trata mai multe boli, în special de tip respirator. Aerul salinelor este sãrac în particule de praf care ar putea sta la baza unor reacţii alergice sau a unor atacuri de astm. Acest fapt reduce iritaţia şi astfel, simptomele de boalã sunt reduse sau chiar complet eliminate pe timpul şederii pacientului în salinã. Tratarea astmului presupune staţionarea pacientului în subteran pentru 2-3 ore pe zi, timp de 2-3 luni. Un studiu mai vechi descrie un regim speleoterapeutic de 4 ore /zi timp de 6-8 sãptãmâni, pentru 100 de pacienţi cu boli pulmonare obstructive cronice şi astm. Rezultatele studiului au aratat o îmbunãtãţire a sãnãtãţii pacienţilor ce a durat între 6 luni şi 7 ani (Skulimowski, 1965). Astmul este o boală caracterizată prin inflamaţia cronică a căilor respiratorii ce devin astfel hiper-responsive şi prin schimbări în arhitectura acestora. Studii recente au sugerat că funcţia celulelor epiteliale, a celulelor musculare netede şi a fibroblaştilor din culturi obţinute din plamanii persoanelor cu astm diferă de funcţia celulelor cultivate în mod similar de la persoane sãnãtoase, fără astm. Aceste diferenţe funcţionale, legate de reparare şi remodelare, ar putea contribui la modificarea structurală a căilor respiratorii (Sugiura et al., 2007).
Obiectiv: Explorarea efectelor speleoterapiei asupra morfologiei şi fiziologiei fibroblastelor dermale şi pulmonare obţinute din ţesuturi prelevate de la şobolani Wistar, în condiţii normale şi dupã sensibilizare cu Ovalbuminã pentru inducerea experimentalã a stãrii de astm. Materiale şi metode: Înainte de iniţierea culturilor de fibroblaste dermale şi pulmonare, 60 de şobolani Wistar de 75-100 g au fost separaţi în douã loturi: control şi sensibilizaţi cu Ovalbuminã. Câte 10 animale din fiecare lot au fost trimise la salinele Turda, Cacica şi Dej şi menţinute într-un regim de speleoterapie. Alte 10 animale din fiecare lot au fost monitorizate separat în Biobaza INRMFB. Culturile de fibroblaste dermale şi pulmonare au fost iniţiate prin tehnici enzimatice din ţesuturi corespunzãtoare prelevate de la şobolani Wistar din fiecare lot. Monitorizarea morfologicã a fost realizatã prin microscopie opticã în contrast de fazã, iar modificãrile biochimice şi moleculare ale culturilor obţinute de la animale supuse tratamentului speleoterapeutic, faţã de control, au fost stabilite experimental prin tehnici de electroforezã şi Western Blotting.
0,04 0,03 0,02 0,01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 S1 30 25 20 15 10 LDH CREATININA 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 S1 40 30 20 10 FOSFATAZA ALCALINA 2.5 2 1.5 1 0.5 UREE 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 S1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 S1 Ligand A Wnt PLC PI PIP2 γ D M A CMP-PA U inositol G N IP3 C IMPase - IP IMPase IP2 + + - Ca 2+ + Li Phosphorylation, Translocation of transcription factors + Regulation of PKC responsive genes β PKC α Lithium-Responsive Gene Network Long-term Lithium Effects AXIN Frizzled APC β-catenin Dsh PP2A - - - GSK-3β β-catenin + TCF/LEF TCF/LEF responsive genes PI-3K Akt/PKB Li + GBP P β-catenin - Protein degradation SYNAPTIC FUNCTION NEUROPLASTICITY NEUROPROTECTION
NORMALI (sanatosi clinic) ASMATICI (ovalbumina) Asmatici tratati in Salina Turda
Electroforeza proteinelor din lizatul celular omogen total are ca scop stabilirea schimbărilor aparute la nivelul expresiei proteice generale a culturilor obţinute de la şobolanii supuşi tratamentului speleoterapeutic. Analiza electroforetică demonstrează prin creşterea expresiei unor proteine şi a nivelului total de proteine din omogenatul celular dupã expunerea animalelor ovalbuminsensibilizate la mediul din Salina Turda confirmand observaţiile morfologice, care aratau o inversare a proceselor morfopatologice ale fibroblastelor pulmonare din culturã; Analiza densitometricã pentru evaluarea cantitãţii relative de proteinã s-a efectuat cu ajutorul sistemului SCIE-PLAS VISION, utilizãnd soft-ul de analizã a gelurilor GeneTools de la SYNGENE, versiunea 4.00
Electroforeza ACTINA GSK-3β Citocrom C Western blotting Dupa electroforeza, proteinele separate pe gel sunt transfertate electric pe o membrana de nitroceluloza cu ajutorul aparatului de blotare, conectat la un curent electric de 300 ma si 100 V. Imunodetectia actinei, GSK-3β si citocrom C a fost realizata indirect prin metoda imunoperoxidazei. Membrana de nitroceluloza a fost spalata cu tampon fosfat salin si incubata cu 2% BSA- albumina serica bovina pentru indepartarea siturilor nespecifice de legare. In urmatoarea etapa are loc incubarea peste noapte cu anticorpul primar la 4 0 C. Toti anticorpi primari au fost diluati in PBS cu 2% albumina serica bovina. Ulterior, dupa o spalare cu PBS, membrana este incubata cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidaza timp de o ora, la temperatura camerei. Complexul imun este detectat in prezenta a 0.05% 3,3 DAB - diaminobenzidina si 0.015% H 2 O 2 in PBS. 4-5-6-7-8-9 µg BSA
Concluzii Tratamentul speleoteraputic al şobolanilor Wistar a determinat diferenţe semnificative în morfologia şi expresia proteicã a fibroblastelor dermale şi pulmonare cultivate în laborator. Aceste diferenţe susţin efectele protective ale speleoterapiei prin comparaţie cu datele obţinute de la animalele netratate şi sensibilizate cu Ovalbuminã, având indusã starea experimentalã de astm. Studiul de faţă susţine ideea că fibroblastele modificate fenotipic pot contribui la remodelarea căilor respiratorii în astm. Fibroblastele cultivate din plamani de la animale sensibilizate cronic cu ovalbuminã au demonstrat creşterea în mod constant a unor răspunsuri reparatorii la un număr de teste funcţionale.
Institutul Naţional de Recuperare, Medicină Fizică şi Balneoclimatologie atologie Va multumesc! Dr. Biol. Constantin Munteanu www.cell-culture. culture.xhost.ro Email: secretar@b @bioclima.ro