DETERMINAREA ALCOOLEMIEI PRIN METODA GAZ-CROMATOGRAFICĂ Masterand: DAVID (MUNTEANU) DANIELA ȘTEFANIA Cursant anul II la Didactica Chimiei
CUPRINS: 1. Introducere 2. Metoda de analiză 3. Rezultate și discuții 4. Concluzii 5. Bibliografie
1. INTRODUCERE Determinarea alcoolemiei ca mijloc de probă în justiţie constituie atributul laboratoarelor de toxicologie medico-legală şi se poate face prin metoda oficială de chimie analitică şi/sau prin metoda gaz-cromatografică, în conformitate cu avizul Consiliului Superior de Medicină Legală Dezvoltarea unei metode de dozare a alcoolului prin metoda cromatografiei în fază gazoasă trebuie urmată de procedura validării acesteia, confom prevederilor normei ISO 17025:2005 privind acreditarea laboratoarelor şi prin aplicarea metodologiei din norma ISO 5725-2:1994 (ambele emise de Organizaţia Internaţională pentru Standardizare)
Prin analiza gaz-cromatografică (GC) se obţine o separare a substanţelor volatile, fiind posibilă identificarea şi dozarea alcoolului etilic din sângele total. După trecerea printr-o coloană de separare, moleculele de etanol sunt recunoscute de un detector cu ionizare în flacără (FID) care produc un semnal electric ( peak ) proporţional cu cantitatea de analit. Parametrii esenţiali sunt: Timpul de retenţie corespondentul calitativ: fiecare substanţă volatilă migrează cu viteză diferită şi ajunge la detector după un interval de timp bine determinat de la injectare. Aria semnalului corespondentul cantitativ: este proporţională cu cantitatea de substanţă de analizat din probă
Este o metodă rapidă, precisă, nu necesită reactivi şi are avantajul că se pot determina concomitent şi alte substanţe volatile din proba analizată. Există câteva variante de analiză GC: Cu injecţie directă a probei: necesită prepararea prealabilă iar în timp are loc o poluare a segmentului iniţial al coloanei; timpul de analiză este scurt, de câteva minute. Analizarea fazei de vapori ce rezultă la preîncălzirea probei la o temperatură prestabilită (tehnica head-space HS-GC): se elimină interferenţele cu alţi compuşi nevolatili, nu necesită prepararea probei (ci doar adăugarea standardului intern); timpul de analiză este mai lung, optimizarea se poate realiza prin autosampler dispozitiv de încărcare automată a probelor. Analizarea cu sistemul HS, însă cu dublă coloană şi dublu detector, pentru confirmarea peakului de etanol.
CROMATOGRAMA COMPARATIVĂ A UNEI PROBE DE SÂNGE FĂRĂ ALCOOL CU A UNEI PROBE DE SÂNGE CU ALCOOL
MODELE DE APARATE GC PENTRU TESTAREA ALCOOLEMIEI
2. METODA DE ANALIZĂ Metoda de dozare a alcoolemiei am realizat-o pe un gazcromatograf marca Konik cu dispozitiv headspace, coloană capilară cu lungimea de 30 de metri şi diametrul de 0,53 mm, detector cu ionizare în flacără (FID), având ca gaz purtător azotul, iar gazele detectoare hidrogenul şi aerul comprimat. În cuva ce conţine coloana capilară se menţine o temperatură constantă de 30 C, temperatura detectorului este 250 C, presiunea H 2 este de 4 psi iar a azotului 10 psi. Proba de sânge împreună cu standardul intern (în proporţii egale) se preîncălzesc în head-space timp de 10 minute la 80 C.
Selectivitatea metodei a fost testată prin analizarea unui amestec multicomponent format din metanol, etanol şi acetonă, cu evidenţierea semnalelor individualizate la timpi de retenţie diferiţi pentru fiecare analit. În vederea realizării curbei de calibrare am folosit următoarele: - sânge total prelevat de la un voluntar care nu a consumat alcool în ultimele 24 de ore; - etanol pur Merck - pe care l-am amestecat şi omogenizat cu sângele prelevat. - am obţinut următoarele concentraţii:500 mg/100 ml,1,000 mg/100 ml, 2,000 mg/100 ml, 4,000 mg/100 ml și8,000 mg/100 ml - ca standard intern am folosit t- butanol Riedel de Heien cu concentraţia de 0.5 Am verificat liniaritatea metodei, prin calcularea coeficientului de corelaţie.pentru estimarea limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare am analizat cinci probe negative ( blanck -uri). Formula de calcul se bazează pe adăugarea a trei, respectiv zece deviaţii standard la media determinărilor. Pentru stabilirea preciziei (repetabilităţii) metodei am efectuat 5 determinări consecutive în aceeaşi zi, am repetat aceeaşi procedură şi în zilele următoare. Am calculat deviaţia standard relativă (RSD) prin raportare la media rezultatelor şi am exprimat-o procentual.
CALIBRAREA ȘI VERIFICAREA LINIARITĂȚII PROBEI Număr probă Valoarea 1. 500 mg/100 ml 2. 1,000 mg/100 ml 3. 2,000 mg/100 ml 4. 4,000 mg/100 ml 5. 8,000 mg/100 ml
3. REZULTATE ȘI DISCUȚII Liniaritatea exprimă capacitatea metodei de analiză de a furniza, în interiorul unui domeniu de concentraţie limitat, semnale analitice proporţionale cu concentraţia, ceea ce se traduce prin rezultate analitice de foarte bună calitate, de încredere şi deci acceptabile. Coeficientul de corelaţie minim este de 0.995. Cel obţinut de noi a fost iniţial de 0.997, iar la o nouă calibrare de 0.999, examinarea vizuală a punctelor reziduale fiind şi ea concludentă. Limita de detecţie are o valoare informativă şi se referă la concentraţia minimă detectabilă a substanţei de analizat (a etanolului). Limita de cuantificare reprezintă cantitatea minimă de analit care se poate doza cu o siguranţă rezonabilă, deci cu exactitate şi fidelitate acceptabile. Pentru acest parametru de validare la metoda noastră amobţinut valoarea de 0.15 g/l.
DETERMINAREA ALCOOLEMIEI PENTRU MAI MULTE PROBE DIN ACELAȘI SÂNGE
Urmărind standardele de performanţă şi pragurile de alcoolemie pozitivă stabilite în diverse ţări, constatăm un palier de valori între 0.10 g/l şi0.20 g/l. Menţionăm că în România nu a fost definit un astfel de prag, fiecare laborator stabilindu-şi limita de la care exprimă valoric concentraţia de alcool din sânge. Pentru concentraţia de alcool din aerul expirat există o circulară internă a IGP care stabileşte ca valori pozitive numai cele care sunt mai mari de 0.10 mg/l. Menţionăm că există norme legale sau profesionale care acceptă abateri de până la 10% în cazul dozării alcoolului în scop medico-legal.rezultatele analizei au fost de 0.794, 0.830 şi 0.778 pentru etalonul de 0.60 g/l. Acurateţea se încadrează în limita a ± 3,75%. Existenţa de alcool restant pe coloana de separare se înscrie în limitele admise citate în literatură, de 1 2%, şi justifică necesitatea rulării obligatorii de probe negative după fiecare serie de 5-10 analize.
4. CONCLUZII Metoda propusă poate fi validată ştiinţific, având performanţele descrise ce se încadrează în criteriile stabilite în alte ţări şi în literatura de specialitate. Introducerea în România a metodei de dozare a alcoolului din sânge prin metoda gazcromatografică necesită stabilirea unor standarde minime de performanţă care trebuiesc îndeplinite, în paralel cu preocupările pe care trebuie să le aibă fiecare laborator pentru asigurarea validării ştiinţifice şi a transparenţei rezultatelor. Pentru controlul extern de calitate este nevoie de studii de reproductibilitate interlaboratoare în care să fie implicate toate unităţile medico-legale ce realizează determinarea alcoolemiei. Exprimarea rezultatelor finale trebuie să ţină seama de performanţele metodei, prin deducerea erorilor din valoarea măsurată, în baza principiului in dubio pro reo. Prin recunoașterea ca validă a aceastei metode trebuie propusă introducerea ca normă legală sau profesională pentru limita de cuantificare a alcoolului în sânge valoarea de 0.20, sub care rezultatele să fie exprimate ca negative.
5. BIBLIOGRAFIE 1. Pietrzyk DJ, Frank CW. Chimie analitică. Editura tehnică Bucureşti, 1989. 2. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R: Validarea metodelor de analiză şi control. Baze teoretice şi practice. Editura medicală, Bucureşti, 1998. 3. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R, Muntean DL. Validarea metodelor analitice. Editura Medicală, Bucureşti 2007. 4. Schmitt G, Aderjan R.: Blood alcohol analysis validation and determination of the measurement inaccuracy according to international standards. Blutalkohol, 2004; 41: 299-317. 5. *** California Code of Regulations Title 17, Division 1, Chapter 2, Group 8: Forensic Alcohol Analysis and Breath Alcohol Analysis http://www.drugdetection.net/ 6. *** Standard operating procedure, Determination of Blood Alcohol. University of Colorado at Denver, September 15, 2004 - Revision 1.10. http://thunder1.cudenver.edu/clas/sasl/techniques/blood_alco hol.pdf.