Universitatea de Medicină şi Farmacie Craiova TEZĂ DE DOCTORAT CONTRIBUŢII LA STUDIUL INTERACŢIUNII STROMĂ-EPITELIU ÎN CARCINOMUL BAZOCELULAR. STUDIU HISTOLOGIC ŞI CLINICO-STATISTIC - REZUMAT - COND. ŞT. prof. univ. emerit Dr. Florin BOGDAN DRD. Alexandru PIRICI CRAIOVA 2011
CUPRINSUL TEZEI Lista de abrevieri... 7 Introducere... 8 STADIUL CUNOAŞTERII CAP. I: Morfofiziologia pielii... 10 CAP. II: Tumorile - histopatologie... 27 CAP. III: Carcinomul bazocelular... 36 CONTRIBUŢII PROPRII Obiectivele studiului... 61 CAP. IV: Material şi metodă... 62 CAP. V: Rezultate... 93 CAP. VI: Discuţii... 173 CAP. VII: Concluzii... 187 Bibliografie... 189 Anexă cu lucrările personale... 196 3
INTRODUCERE Carcinomul bazocelular este o tumoră epitelială ce se dezvoltă şi depinde de epiderm. Incidenţa creşte în mod liniar dupa vârsta de 40 de ani iar localizarea este in 2/3 din cazuri în regiunea cervico- facială. Carcinomul bazocelular este cel mai frecvent cancer cutanat cu malignitate strict locală care pune rareori probleme de prognostic vital. Totuşi, unele forme au un potenţial distructiv important cu consecinţe uneori grave din punct de vedere estetic, funcţional şi al calităţii vieţii. Cei mai importanţi factori în apariţia carcinomului bazocelular sunt cei genetici şi de mediu. Fenotipul, dependent de factorii genetici, joacă un rol important în epidemiologia cancerului cutanat, constatandu-se că cele mai multe cazuri afectează fototipurile I şi II. Pe fondul acestei predispoziţii, factorii de mediu şi în special expunerea la radiaţiile ultraviolete reprezintă un factor de risc major, în unele cazuri chiar determinant in apariţia cancerului pielii sau transformarea malignă a unor leziuni preexistente. Trebuie remarcat faptul că nici o altă formă de cancer nu se pretează mai mult la realizarea unei profilaxii eficiente precum carcinoamele cutanate. Aceasta este cu atât mai uşor de înfăptuit cu cât acest tip de cancer se localizează de predilecţie pe părţile descoperite ale pielii şi prin aceasta foarte accesibil observaţiilor clinice, examenului histopatologic şi aplicării mijloacelor terapeutice. Se stabileşte asfel dacă tumora a fost indepărtată în totalitate, evitându-se eventualele recidive iar în cazul carcinomului bazocelular vindecarea. În prezenta lucrare mi-am propus evaluarea corelaţiei morfofuncţionale existente între epiteliu şi stromă în carcinomul bazocelular, cu unele aspecte clinice şi de prognostic. Urmărirea caracterelor care s-au modificat în procesul neoplazic s-a realizat printr-un studiu histologic, histometric şi imunohistochimic. 4
Cuvinte cheie: carcinom bazocelular, histopatologie, citokeratine, actina de muschi neted, index de proliferare, index apoptotic. I. STADIUL CUNOAŞTERII Capitolul I - Morfofiziologia pielii descrie elemente clasice de embriologie şi anatomie ale organului cutanat, cu urmărirea ca entităţi separate a epidermului, membranei bazale, dermului, hipodermului şi anexelor cutanate. Descrierea se face de la nivel de tesut pana la nivelul componentelor celulare si stromale individuale, cu exemplificarea funcţiilor fiecărui component în parte. Este discutată de asemenea şi structura electronomicroscopică a unor elemente de importanţă deosebită pentru tema aleasă, cum ar fi structura membranei bazale. Capitolul II intitulat Tumorile în generalhistopatologie este o introducere în morfopatologia tumorilor umane, care apoi se axează pe tumorile cutanate în general. După o scurtă descriere a caracterului de clonalitate al celulelor tumorale, se trec în revistă caracterele morfologice ce diferenţiază tumorile maligne de cele benigne, criteriile de clasificare ale tumorilor maligne şi importanţa studiului combinat al stromei şi parenchimului tisular. Capitolul se axează apoi pe caracterele tumorilor cu localizare cutanată. (i) Tumorile cutanate benigne sunt formaţiuni proliferative cu celule normale, neinflamatorii, derivând din structurile pielii. Ele se clasifică în: tumori benigne epiteliale (de natura virală, veruca seboreică, keratoacantom), tumori benigne ale anexelor (tumori ale glandelor sudoripare, tumori ale glandelor sebacee, tumorile foliculului pilos), tumori epiteliale de retenţie, tumori ale sistemului melanocitar, tumori 5
ale ţesutului conjunctiv, adipos, muscular, vascular, nervos, tumori cartilaginoase şi osoase. (ii) Unele leziuni cutanate cu evoluţie cronică, în aparenţă banală, pot reprezenta faze premergătoare ale cancerului şi sunt considerate precanceroze, putând evolua cu o frecvenţă ridicată spre transformare malignă. Ele sunt clasificate ca: precanceroze cu potenţial crescut de transformare (xeroderma pigmentosum, boala Bowen, sindromul Sezary), precanceroze cu potenţial mediu de transformare (lichenul scleros vulvar, balanita xerotica obliterantă, leucoplazia vulvară), precanceroze cu potenţial redus de transformare (keratoacantomul, nevii piloşi giganţi, melanozele actinice), precanceroze cu potenţial foarte redus de transformare (chisturi sebacee, cicatricile, verucile). (iii) Tumorile maligne cutanate reprezintă 15-20% din totalul cancerelor. În majoritatea cazurilor, manifestările maligne ale pielii apar pe leziuni precanceroase asupra cărora acţionează numeroşi factori carcinogeni din mediul extern. Clasificarea cancerelor cutanate se face pe criteriul histogenezei lor, deosebindu-se patru grupuri principale: carcinoame cutanate (bazocelulare, spinocelulare, adenocarcinoame), melanoame maligne, sarcoame cutanate, limfoame cutanate. În capitolul III intitulat Carcinomul bazocelular se descriu date generale legate de epidemiologia, patogeneza, clinica şi morfopatologia carcinoamelor bazocelulare (CBC) în general. Cracinoamele bazocelulare (CBC) se localizează în 90% din cazuri la nivelul extremităţii cefalice, în special la nivelul feţei. Cu excepţia sindromului carcinomului bazocelular nevoid, ele apar rar pe palme sau pe plante. Apariţia lor pe mucoase este controversată; exemplele de carcinom bazocelular pe mucoasa orală citate în literatură sunt probabil în majoritate ameloblastoame. Carcinoamele bazocelulare 6
apar de obicei ca leziuni unice, deşi apariţia mai multor leziuni, simultan sau consecutiv, nu este de neglijat. În jur de 40% din pacienţii care au avut un carcinom bazocelular vor dezvolta încă unul sau mai multe carcinoame bazocelulare în următorii 10 ani de viaţă. Deşi carcinoamele bazocelulare pot apărea fară un motiv anume, s-au descris numeroşi factori implicaţi în apariţia carcinoamelor bazocelulare. Cel mai comun dintre ei este pielea albă (fototip I sau II) în asociaţie cu expunerea prelungită la soare. Alţi factori care predispun o persoană la a dezvolta atât un carcinom bazocelular cât şi un carcinom scuamocelular sunt şi dozele crescute sau numeroase de radiaţie roentgen, şi mai rar cicatrici post arsuri, precum şi alte cicatrici. De regulă, carcinoamele bazocelulare nu metastazează. Cu toate acestea, există şi excepţii. Incidenţa metastazelor variază de la 0,01% în probele patologice, până la 0,028% la pacienţii cu afecţiuni dermatologice şi 0,1% la pacienţii din centrele chirurgicale. Există în literatură mai multe clasificări ale formelor clinice de carcinom bazocelular, dintre care cele mai importante sunt cele date de NHMRC (National Healt Medical Researsh Council), BAD (British Association of Dermatologists), NCCN (National Comprehensive Cancer Network), EMC (Encycl.Med.Chir.Dermatol.), Degos, Rook, Fitzpatrick. Teza se axează apoi pe cele şapte tipuri clinice acceptate de Societatea Română de Dermatologie (SRD): 1. carcinomul bazocelular nodular 2. carcinomul bazocelular perlat (plan cicatricial) 3. carcinomul bazocelular ulcerat 4. carcinomul bazocelular morfeiform sau sclerozant 5. carcinomul bazocelular superficial (pagetoid) 6. carcinomul bazocelular chistic. 7. carcinomul bazocelular pigmentar 7
Carcinoamele bazocelulare împărtăşesc caracteristici comune ale celulelor stratului bazal epidermal: palisadare a nucleilor celulelor periferice, o stromă specializată precum şi artefacte de tip clefturi la joncţiunea dintre epiteliu şi stromă. În plus, există grade variate de atipie citologică şi activitate mitotică; iar un anumit nivel al acestor ultime două modificări este aproape mereu prezent. Din punct de vedere histologic, carcinoamele bazocelulare, pot fi împărţite în două grupe mari: nediferenţiate (solide) şi diferenţiate. In cele diferenţiate celulele neoplazice tind să reproducă structuri pilare, sebacee sau sudoripare. O linie de demarcaţie clară între cele două grupuri nu poate fi trasă deoarece multe carcinoame bazocelulare nediferenţiate arată o diferenţiere în anumite zone, iar cele mai bine diferenţiate carcinoame bazocelulare prezintă zone lipsite de diferenţiere. Cele cu diferenţiere către structurile firului de păr sunt numite keratotice; cele către glandele sebacee: carcinoame bazocelulare chistice; iar cele către glandele apocrine sau ecrine carcinoame bazocelulare adenoide. A fost, de asemenea, descrisă o variantă cu celule în inel cu pecete. Carcinoamele bazocelulare nediferenţiate, denumite şi carcinoame bazocelulare solide, pot fi împărţite în circumscrise şi infiltrative. Desi în aproximativ 75% din carcinoamele bazocelulare se descoperă prezenţa melanocitelor şi melaninei în aproximativ 25% dintre acestea, cantităţi mari de melanina sunt rareori întîlnite. Melanina este produsă de către melanocitele benigne care colonizează tumora. Aceste tumori sunt numite carcinoame bazocelulare pigmentate. Carcinomul bazocelular superficial prezintă proliferări neregulate şi muguri de celule tumorale pe faţa internă a epidermului. Carcinomul bazocelular fibrozant, morfeiform are aspectul unor cordoane înguste, adesea formate dintr-un singur rând de celule tumorale incluse întro stromă densă, fibroasă. 8
Ţesutul canceros are două componente: celulele canceroase şi stroma. Stroma este un ţesut conjunctivovascular non tumoral prezent în toate tipurile de cancer (nu şi în leucemie), cu rol de susţinere, în nutriţia, creşterea şi diseminarea tumorală. Stroma cancerelor are un aspect variat. Unele tumori au o stromă abundentă, fibroasă (ex. Boala Hodgkin), subţire (cancere endocrine, sarcoame), metaplazică (osoasă), amiloidă, limfoidă, eozinofilică, histiocitară. În CBC, stroma conjunctivă proliferează odată cu tumora şi este aranjată în fascicule paralele în jurul maselor tumorale, astfel încât pare să existe o relaţie reciprocă între parenchimul tumorii si stroma sa. Stroma adiacentă maselor tumorale prezintă adesea numeroşi fibroblaşti tineri şi uneori poate căpăta un aspect mixoid. Frecvent apar zone de retracţie ale stromei dintre insulele tumorale, fapt ce duce la formarea de lacune peritumorale. Aceste lacune au fost considerate în trecut ca şi artefact de fixare, dar lacunele peritumorale pot fi observate, de asemenea, pe secţiuni tăiate la criostat. În CBC solid stroma înconjurătore capătă un aspect mixoid, rar este fibrotică şi poate arăta semne de calcificare discretă. Mitozele şi necroza celulară individuală sunt neobişnuite. Fantele de retracţie apar în mod obişnuit. În CBC micronodular stroma are un aspect mixoid, cu un carcater fibrozant accentuat, fără fante de retracţie, ceea ce dă acestor leziuni un caracter intermediar între forma solidă şi cele infiltrative cu creştere agresivă. În CBC morfeiform se identifică o fibroză şi o creştere a numărului fibrocitelor în jurul insulelor tumorale, fără fante de retracţie, iar studii de microscopie electronică au arătat că membrana bazală lipseşte în aceste cazuri. În CBC infiltrativ stroma este frecvent fibrotică, cu apariţia unui număr crescut de fibroblaşti. 9
În CBC pigmentar, de multe ori încărcarea cu melanină se face nu numai în celulele bazaloide, dar şi în histiocitele stromale, aspect cel mai des întâlnit în CBC solid şi superficial. Din punct de vedere al tipului imunohistochimic, celulele care alcătuiesc insulele de carcinom bazocelular sunt imuno-pozitive pentru keratine (în special keratinele cu masă moleculară mică), şi de obicei negative pentru antigenul epitelial membranar (EMA), antigenul carcino-embrionar (CEA), şi involucrină. De asemenea anticorpul MAK-6 (o altă pancitokeratină) este negativă în CBC. Membrana bazală ce înconjoară cuiburile tumorale reacţionează cu anticorpi anti-laminină, colagen IV, colagen V şi antigenul pemfigoidului bulos. Reactivitatea pentru aceşti anticorpi tinde să varieze în intensitate şi în continuitate în formele mai agresive precum CBC morfeiform şi infiltrativ. Diagnosticul diferenţial al CBC în general şi în particular a variatelor sale forme se face cu: o Carcinomul spinocelular cu perle keratotice (bine diferenţiat), faţă de CBC keratozic. o Carcinomul spinocelular cu perle keratotice (bine diferenţiat), faţă de CBC metatipic. o o o Tricoepiteliomul, faţă de CBC cu diferenţiere foliculară în special. Tumori sebacee, faţă de CBC cu diferentiere sebacee. Cilindromul 10
II. CONTRIBUŢII PROPRII Studiul de faţă a abordat următoarele aspecte: - Care a fost frecvenţa CBC în jud. Vâlcea în perioada 1999-2007. - Care sunt caracterele epidemiologice ale cazurilor de CBC din regiunea şi perioada de timp analizate? - Analiza particulărităţilor morfologice în funcţie de forma clinică. - Există corelaţii între principalii markeri folosiţi în descrierea imunohistochimică a CBC? - Dintre aceşti markeri se pot identifica antigene cu rol prognostic pentru evoluţia şi extensia tumorală? Capitolul IV intitulat Materiale şi metode are ca prim obiectiv descrierea materialului de studiu precum şi a tehnicilor folosite. Materialul nostru de bază este constituit din totalitatea cazurilor raportate ca neoplazii ale pielii de către Spitalul Judeţean Vâlcea în perioada 1999-2007, şi confirmate prin diagnostic anatomo-patologic al serviciului de anatomie patologică al Spitalului Judeţean Vâlcea (Tabel 1). În total, în intervalul 1999-2007, au fost înregistraţi şi confirmaţi în registrul serviciului de dermatologie al Judeţului Vâlcea 1689 pacienţi cu afecţiuni cutanate, din care 253 au fost cazuri diagnosticate drept carcinom bazocelular, 100 de carcinom spinocelular, 16 de melanom malign, 24 de boală Kaposi, şi 1296 de leziuni precanceroase. 11
An Carcinom bazocelular Carcinom spinocelular Melanom malign Boala Kaposi Leziuni precanceroase 1999 15 5 0 6 141 2000 26 4 1 4 144 2001 24 7 5 1 250 2002 26 8 2 1 127 2003 25 14 1 0 132 2004 34 10 1 0 119 2005 20 15 3 5 143 2006 44 20 0 4 138 2007 39 17 3 3 102 Total 253 100 16 24 1296 1689 Tabel 1. Spectrul patologiei dermatologice în judeţul Vâlcea între anii 1999-2007. În scopul documentării s-au utilizat foile de observaţie clinică ale pacienţilor, buletinele anatomopatologice si iconografia clinică culeasă în timpul examinării / intervenţiei excizionale (datorită caracterului cel mai frecvent local al CBC, această conduită de tratament de primă intenţie impunânduse în majoritatea cazurilor). S-au respectat în toate cazurile normele deontologice şi s-a păstrat anonimatul subiecţilor luaţi în studiu. Modalităţile de tratament utilizate pentru CBC (şi implicit recoltarea materialului de studiu) au fost reprezentate de excizia chirurgicală şi electrocauterizare, în funcţie de localizarea, dimensiunea şi vârsta pacientului. Materialul histologic studiat a cuprins piese excizionale recoltate în secţia de Dermato-Venerologie a spitalului Judeţean Vâlcea în perioada 1999-2007. Din cele 253 de cazuri confirmate ulterior drept carcinom bazocelular, au fost selectate randomizat 50 de cazuri pentru studiul imunohistochimic (Tabel 2). 12
Forma histopatologica Nr de cazuri Procent Solid 25 50.00% Morfeiform 9 18.00% Infiltrativ 8 16.00% Adenoid 6 12.00% Superficial 2 4.00% Total 50 Tabel 2. Subtipurile histopatologice de CBC din lotul de studiu Materialul biologic excizional a fost fixat imediat după rezecţie în formalină neutră tamponată 10%, fiind prelucrat ulterioar pentru includerea la parafină. Menţionăm că totuşi timpii de fixare nu au fost constanţi, ţesutul fiind arhivat în bazele de material ale secţiei de Anatomie Patologică ale Spitalulu Judeţean Vâlcea. Din piesele incluse la parafină au fost tăiate secţiuni seriate cu grosimea de 4 μm cu ajutorul unui microtom rotativ, fiecare secţiune fiind transportată pe o cascadă de apă din dreptul cuţitului microtomului într-o baie de apă rece. De aici secţiunile au fost culese cu o lamă din sticlă şi depuse pe suprafaţa unei băi de apă caldă (39 C). Aici suprafaţa secţiunilor s-a îndreptat iar înainte de topirea completă a parafinei, secţiunile au fost preluate pe lame acoperite cu polilizină. Histochimic, s-au utilizat procedee clasice de coloraţie precum hematoxilină-eozină, verde de lumină după metoda Goldner-Szeckelly şi PAS (Acid Periodic Schiff). Pentru studiul imunohistochimic am utilizat acelaşi material biologic folosit şi pentru investigaţiile histologice, adică cele 45 de cazuri de CBC confirmate histopatologic prin investigaţiile de rutină descrise anterior. Tehnica de imunohistochimie propriu-zisă a cuprins un algoritm standard, cu unele variaţii în funcţie de anticorpii folosiţi (Tabelul 3). 13
Anticorp Epitop / marker Diluţie Recuperare antigenică Actina de muşchi neted Actina musculară, miofibroblaşti Sursă 1:100 Citrat, ph6 Dako bcl-2 Oncoproteina bcl-2 1:100 EDTA, ph9 Dako Caspaza 3 activata Marker apoptotic 1:101 Citrat, ph6 Cell Signaling CD20cy Limfocite B 1:100 Citrat, ph6 Dako CD3 Limfocite T 1:100 Citrat, ph6 Dako CD31 Endoteliu vascular 1:100 Citrat, ph6 Dako CD34 Endoteliu vascular 1:100 Citrat, ph6 Dako CD68 Macrofage/monocite 1:100 Citrat, ph6 Dako Citokeratina 19 Citokeratina 34βE12 Citokeratină cu masă moleculară mică Citokeratine cu masă moleculară mare 1:100 Citrat, ph6 Abcam 1:100 EDTA, ph9 Dako ki-67 Factor de proliferare 1:50 EDTA, ph9 Dako Laminină Membrane bazale 1:50 Proteinază K Dako Tabel 3. Anticorpii utilizaţi în acest studiu Protocolul standard de imunohistochimie a cuprins: 1. În mod invariabil, primul pas a fost recuperarea antigenică prin fierbere la microunde într-o soluţie specifică aleasă în funcţie de anticorp. Pentru fierbere, vasul cu lamele conţinând soluţia de recuperarea antigenică a fost acoperit cu un capac şi apoi aşezat într-un cuptor cu microunde setat la o putere de 650W. Fierberea a cuprins 7 cicluri de câte 3 minute la puterea dată. 2. Etapa următoare a fost incubarea cu o soluţie de peroxid de hidrogen 1% în apă distilată pentru 30 de minute în vederea blocării peroxidazei endogene care ar putea interfera cu detecţia semnalului. 14
3. Etapa a treia a constat în incubarea secţiunilor într-o soluţie de albumină bovină 1% (în soluţie PBS) pentru alte 30 de minute. 4. Fără spălare, doar prin îndepartarea soluţiei de blocare, s-a adăugat apoi pe lamă anticorpul primar, lamele fiind apoi incubate peste noapte în frigider la 4ºC într-o cutie umedă pentru a preveni uscarea lor. 5. A doua zi lamele au fost scoase din frigider şi lăsate să revină la temperatura camerei pentru 30 de minute. S-au realizat apoi trei spălări abundente în soluţie PBS, fiecare de cel puţin 15 minute. 6. A urmat adăugarea pe secţiuni a sistemului secundar de detecţie, şi anume a unui complex anticorp secundar antianticorp primar legat de un polimer cu multiple molecule de peroxidază (EnVision, Dako). Incubarea s-a facut la temperatura camerei pentru 30 de minute. 7. Ultima etapă a reacţiei a fost cea de detecţie propriuzisă a semnalului. Iniţial secţiunile au fost spălate din nou abundent cu PBS (15 minute x 3 spălări). Detecţia s-a realizat apoi prin incubarea secţiunilor cu un substrat pentru peroxidază în prezenţa unei surse de protoni: 3-3 diaminobenzidină (DAB) în prezenţa de apă oxigenată 1%. În final secţiunile au fost contrastate cu hematoxilină Mayer pentru urmărirea morfologiei, au fost deshidratate, clarificate şi acoperite cu mediu de acoperire pe bază de xilen (DPX, Fluka). Lame selectate aleator (pe fiecare tip morfologic identificat) din grupul coloraţiilor histochimice şi imunohistochimice au fost apoi incluse în algoritmi de morfometrie bi-dimenională. În plus 50 de secţiuni seriate au fost alese din cele mai reprezentative blocuri, au fost imunomarcate pentru vasele de sânge (cu un coctail de anticorpi anti CD31 şi CD34), şi apoi au fost incluse într-un algoritm de morfometrie tridimensională. 15
Lamele colorate (histo sau imuno histochimic) au fost apoi investigate cu ajutorul unui microscop Nikon Eclipse 55i echipat cu obiective plan apocromate, un senzor CCD de 5 Mp şi un soft dedicat de analiză imagistică morfometrică (Nikon NIS-Elements). Zonele de interes au fost fotografiate cu aceleaşi setări pentru iluminare şi contrast, iar imaginile arhivate în format TIF într-o bază de date. Studiul s-a desfăsurat pe o bază de date de mai mult de 500 de imagini microscopice surprinse cu obiective de 20 şi 40. Ulterior imaginile au fost pre-procesate prin aplicarea unor algoritmi de îndepărtare a iluminării neuniforme (background substraction tool) în NIS-Elements. Fiecărei imagini din baza de date i s-a atribuit apoi un grosisment corespunzător cu obiectivul cu care a fost capturată, astfel încât softul de analiză imagistică să poată face corelaţia înre numărul de pixeli / micrometru real în imagine. Morfometria automată bidimensională a urmărit măsurarea pe măşti RGB extrase din semnalul dat de marcarea cu verde de lumină (pentru lamele colorate histochimic), sau DAB (pentru lamele imunocolorate) a intensităţii şi procentului de arie ocupat de semnal, a numărului elemente de interes identificate, a distanţei dintre elementele de interes. Prin acest procedeu s-au urmărit: - Măsurarae semicantitativă a densităţii fibrelor de colagen - Cuantificarea infiltratului inflamator şi efectuarea de comparaţiii între diferite variante patologice. 16 - Calcularea indicilor de proliferare celulară - Cuantificarea ariei ocupate de miofibroblaşti Morfometria tridimensională a utilizat seturi de câte 50 de secţiuni imunomarcate pentru vasele de sânge de pe care s-a fotografiat aceeaşi zonă de interes la nivelul tuturor acestro secţiuni. Ulterior toate cele 50 de imagini RGB captate pe cate un set de lame seriate au fost încărcate într-un stack şi aliniate. Softul Image Pro Plus (Media Cybernetics) are un
astfel de algoritm de aliniere automat care se bazează pe detecţia marginilor şi a diferenţelor de contrast. Astfel, cu intervenţia minimă a invetsigatorului, softul aliniază şi eventual roteşte imaginile din stack astfel încât să redea modificările strructurale de la o secţiune la alta în mod continuu. Acelaşi soft transformă apoi elementele de interes pentru utilizator (în cazul de faţă am urmărit celulele epiteliale şi semnalul imunohistochimic pentru vasele de sânge) într-o reconstrucţie tridimensională de înaltă rezoluţie a epiteliului şi a vaselor din atmosfera conjunctivă înconjurătoare. Fiecare din această reconstrucţie a fost mai mare de 1Gb de date şi a permis măsiurarea în toate cele trei axe a distanţelor dintre vase şi celulele epiteliale, precum şi volumetria epiteliulu şi a ţesutului conjunctiv subiacent. În final, toate datele obţinute atât prin morfometria clasică cât şi prin analiza fractală au fost colectate în pagini Excel, grupate pe categorii şi comparate utilizând testul t student şi testul Anova. Capitolul IV - Rezultate prezintă în 5 puncte principalele rezultate ale lucrării, după cum urmează: 1. Studiul epidemiologic a arătat că evoluţia incidenţei CBC confirmat anatompotologic a fost oscilantă, înregistrînd totuşi maxime pentru anii 2006-2007 (Figura 1). 17
Incidenta carcinomului bazocelular (1999-2007) Incidenta 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 44 39 34 26 24 26 25 20 15 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Figura 1. Incidenţa oscilatorie a CBC între 1999-2007 Carcinomul spinocelular a avut o incidenţă de 2 de ori mai redusă comparativ cu CBC, fiind urmat descrescător de melanomul malign şi boala Kaposi. (Figura 2). Evolutia cumulata a leziunilor cutanate (1999-2007) Incidenta 300 250 200 150 100 50 0 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Carcinombazocelular Leziuni precanceroase Carcinomspinocelular Melanom malign Boala Kaposi Figura 2. Incidenţa comparată a patologiei dermatologice între 1999-2007 18
Studiul repartiţiei pe sexe a CBC arată o predominanţă a sexului masculin (cu excepţia anilor 2000 şi 2006), cu o tendinţă de egalizare între cele două categorii pentru anii 1999, 2006 şi 2007. Studiind cazurile pe medii de provenienţă s-a observat că pacienţii din mediul rural au predominat în mod evident (178 de pacienţi confirmaţi) faţă de cei din mediul urban (75 de pacienţi confirmaţi). Urmărind repartiţarea pe grupe de vârstă, incidenţa maximă a CBC a fost între 60-80 de ani şi a fost identică pentru toţi anii luaţi în studiu, cu excepţia anului 1999 unde s-a descris un minim al evoluţiei (Figura 3). Incidenta 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Repartitia pe ani a incidentei CBC 2006 2004 2007 2002 2006 2007 2003 2001 2006 2004 2000 2000 2005 2003 2001 2002 2007 2005 2007 2004 2003 2006 2001 2000 1999 1999 2005 2006 2002 2002 1999 2004 2003 1999 2000 2007 2004 2001 2000 2005 2000 2006 2007 1999 2002 2006 2007 2005 2004 2002 2003 2000 2001 1999 2006 2007 2005 2004 2002 2003 1999 2000 2001 2006 2007 2005 2004 2002 2003 1999 2001 2005 2004 2002 2003 1999 2001 2005 2003 2001 2000 6-7 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Figura 3. Incidenţa maximă a CBC între 60-80 de ani Evoluţia comparativă arată o incidenţă maximă a leziunilor premaligne între 10-20 de ani, cu scăderea graduală odată cu vârsta. Toate celelalte entităţi au o evoluţie (mai mult sau mai puţin accentuată) opusă, ascendentă peste vârsta de 49 de ani, proporţională cu numărul total de cazuri (Figura 4). 19
Evolutia diferentiata a leziunilor cutanate 45.0 40.0 35.0 Incidenta 30.0 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 6-7 10-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 Carcinom bazocelular Carcinom spinocelular Melanom malign Boala Kaposi Leziuni precanceroase Figura 4. Incidenţa crescătoare a tumorilor cutanate peste 49 de ani În ceea ce priveşte repartiţia leziunilor pe localizări, faţa, nasul şi toracele au înregistrat densităţi maxime pentru CBC, pentru toţi anii studiaţi. Valorile înregistrate pentru numărul cazurilor cu localizare la faţă (39,9±11) a fost semnificativ mai mare comparativ cu numărul cazurilor cu leziuni pe nas (17±4) sau torace (11,2±7,7) (p<0,001, testul t student) (Figura 5). Analiza integrativă a incidenţelor pe localizări pentru toate leziunile studiate a arătat un trend proporţional descrescător pentru localizarea la faţă, buze, nas pentru majoritatea leziunilor, cu maxime pentru membre şi torace pentru leziunile premaligne şi carcinomul bazocelular. Diferenţe semnificativ statistice s-au înregistrat numai între numărul leziunilor precanceroase şi celelalte patologii (p<0,05, testul t student pe perechi). 20
60 2001 Localizarea CBC 50 2002 2000 40 1999 2005 Incidenta 30 20 10 0 2006 2003 2004 2007 2002 2001 2001 2006 2000 2007 2003 1999 2002 2002 2000 1999 2006 2003 2005 2001 2007 2000 2005 2004 2004 2006 2003 2006 2001 2005 2000 2004 2004 2002 1999 2005 1999 2003 2000 1999 1999 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2007 2007 2007 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 fata buze nas limba membre torace genital 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Figura 5. Localizările cu incidenţă maximă pentru CBC sunt faţa, nasul şi toracele Cea mai frecventă formă clinică detectată de CBC în perioada studiată a fost varianta nodulară (44,3% din cazuistică), urmată apoi de varianta ulcerată (18,6%), perlată (11,9%), chistică (11,5%), morfeiformă (4,3%) şi superficială (2%) (Fig. 6). Analizând cele mai frecvente forme clinice descrise (CBC nodular, ulcerat, perlat, chistic şi morfeiform), am căutat să analizăm mai departe şi corespondentul lor histopatologic. Astfel, pentru CBC nodular, din 112 cazuri descrise clinic, histopatologic 99 s-au dovedit a fi CBC solide, 10 adenoide, iar cate 1 chistic, morfeiform şi superficial. Pentru CBC ulcerat, din 47 cazuri descrise clinic, histopatologic 32 s-au dovedit a fi CBC solide, 7 adenoide, iar 1 bazocelularspinocelular. Pentru CBC perlat, din 30 cazuri descrise clinic, histopatologic 24 s-au dovedit a fi CBC solide, 1 adenoid, 1 morfeiform, şi 1 superficial. Pentru CBC chistic, din 29 cazuri descrise clinic, histopatologic 8 s-au dovedit a fi CBC solide, 21
20 adenoide, şi 1 chistic. Pentru CBC morfeiform, din 11 cazuri descrise clinic, histopatologic 2 s-au dovedit a fi CBC solide, 3 morfeiforme, 3 superficiale, 2 sclerodermiforme şi 1 metatipic. Incidenta formelor clinice de CBC CBC nodular CBC ulcerat CBC perlat CBC chistic 11 29 10 21111112 3 30 47 111 CBC morfeiform CBC superficial CBC adenoid Angiom CBC pigmentat C spinocelular Chist sebaceu Corn cutanat Fibrom Keratoza solara Lichen Nev pigmentar Veruca sebacee Figura 6. Aspectele clinice îmbrăcate de CBC. 2. Studiul clinic a arătat că CBC nodular a fost cea mai frecventă formă descrisă în lotul studiat, cu localizarea cea mai frecventă la nivelul feţei (pleoape, nas) şi gâtului, conform zonelor cel mai expuse la soare. În general aspectul a fost de papulă semidura, roz-rosiatică, cu tendinţa de ulcerare centrală. Carcinomul bazocelular ulcerat s-a prezentat ca o structură exofitică ulcerată (adesea profund), fără a mai avea un chenar perlat vizibil. Localizarea de elecţie a fost nasul la care se adauga regiunile imediat vecine, in special unghiul intern ala ochiului, santul nazogenian, buza superioara, scalpul, urechile (inclusiv conductul auditiv). În general 22
formele ulcerate au necesitat limite de siguranţă de rezecţie mai largi. Carcinomul bazocelular pigmentat s-a înregistrat ca o variantă asociată mai degrabă diferitelor alte forme clinice, cel mai frecvent forma nodulară, însă în câteva cazuri au existat şi forme plane pigmentate. Pigmentarea poate lua tente variabile ca intensitate de la cenuşiu murdar până la cenuşiu negru, cu aspect neomogen, apărând fin granulară, ca împroşcată. Carcinomului bazocelular superficial (pagetoid) este descris ca una sau mai multe pete eritematoase, de dimensiuni variabile, acoperite de scuame, mai rar de mici arii ulcerate, cu contururi rotunjite, net delimitate de un chenar filiform sau minuscule perle pigmentate. Carcinomul bazocelular morfeiform nu a fost foarte frecvent întâlnit. Se prezintă sub forma unei plăci mici, albicioase, cu diametrul de 2-3 centimetri, cu limite imprecise uşor deprimată în raport cu tegumentele învecinate, de consistenţă dură, uneori cu aspect cicatriceal. 3. Studiul histopatologic a arătat că CBC solid a reprezentat cea mai frecventă formă histologică identificată pe piesele luate în studiu, clinic corespunzător formelor solide perlate sau nodo-ulcerative. Se caracterizează prin prezenţa de cuiburi mai mari sau mai mici de celule bazaloide situate la nivelul dermului papilar sau reticular, acompaniate de retracţii stromale (clefturi) caracteristice (Fig. 7). De obicei nu am observat fibroză sau prezenţa unui număr însemnat de fibroblaşti activi. În mod caractersitic, la periferia insulelor de CBC am identificat celule bazaloide dispuse în palisadă, cu nucleii ovalari, hipercromatici şi orientaţi perpendicular pe limita de separaţie componentă epitelială ţesut conjunctiv. Datorită compresiunii intercelulare, în interiorul cuiburilor de CBC celulele îşi pierd caracterul bazaloid şi au o orientare aleatorie a nucleilor. În formele cu minim infiltrat inflamator interstiţial sau cu lipsa acestuia nu am identificat mitoze tipice sau atipice. 23
Figura 7. CBC solid prezenţa cuiburilor de celule bazaloide separate. Col. HE, x 40 De asemenea, densitatea stromei (si implicit a componentei celulare stromale) a fost mai mare spre dermul reticulat comparativ cu dermul papilar (porţiunea apicală a proliferării bazaloide), indicând o reacţie desmoplazică proporţională cu densitatea iniţială a ţesutului conjunctiv înconjurător (Fig. 8). În cazurile de CBC plan, în care de obicei s-a observat un bogat infiltrat inflamator mononuclear peritumoral, acesta a putut fi identificat în dermul superficial încă înainte de apariţia insulelor de CBC propriu-zise, ajutând astfel la identificarea leziunii pe secţiuni seriate consecutive şi crescând şansele unui diagnostic corect. În varianta infiltrativă a formelor solide, celulele bazaloide nu au fost atât de compacte ca în forma solidă simplă, identificând plaje de stromă conjunctivă şi chiar limfocite migrate în epiteliul tumoral (Fig. 9). 24
Figura 8. Palisadare nucleară periferică şi stromă minim reprezentată în regiunea centrală a unui CBC solid multilobat. Col. HE, x 400 Figura 9. Infiltrat inflamator urmat pe secţiuni seriate de pezenţa unui CBC plan. Col. HE., x 100 25
În CBC morfeiform, am identificat insule înguste şi alungite de celule bazaloide înconjurate de o stromă densă, fibroplazică. Insulele celulare au fost alcătuite chiar şi numai din unul sau două rânduri de celule dispuse spate în spate. Retracţiile tisulare epitelio-conjunctivale descrise la varianta solidă au fost aproape absente în aceste cazuri. Citoarhitectura componentei epiteliale a cuprins angulaţii bruşte (chiar şi la 90 ) ale cordoanelor celulare bazaloide precum şi ramificaţii multiple (Fig. 10). Figura 10. CBC morfeiform, aspect general. Col. HE, x 200 Analizând densitatea stromei înconjurătoare am observat că în regiunile superficiale ale insulelor angulate de CBC morfeiform, densitatea fibrelor şi respectiv numărul de nuclei din stromă au fost net mai ridicate în zona profundă a tumorii (derm profund, chiar hipoderm) comparativ cu zona superficială, subepidermică. La examinarea cu un obiectiv de putere, toate cazurile de CBC morfeiform au prezentat un grad accentuat de mitoze tipice, figuri mitotice atipice şi corpi apoptotici comparativ cu CBC solide sau plane. De asemenea, CBC morfeiform au fost însoţite de un abundent 26
infiltrat inflamator cronic peritumoral, cu aceeaşi predominenţă spre partea profundă a tumorii, la joncţiunea cu dermul profund sau hipodermul. În ordinea descrescătoare a frecvenţei, au urmat cazurile clasificate drept CBC adenoid. Microscopic, acestea s-au caracterizat prin dispunerea epiteliului tumoral în aspect dantelat, ce sugera structuri tubulare, glandulare (Fig. 11). Figura 11. CBC adenoid, aspect general. Col. HE, x 40 În special în formele infiltrative am observat prezenţa de celule în mitoză şi chiar de mitoze atipice şi frecvenţi corpi apoptotici. 4. Studiul imunohistochimic s-a axat pe analiza markerilor enumeraţi la capitolul de Materiale si Metode 4.a. Expresia citokeratinelor cu masă moleculară mare a arătat în general o reactivitate puternică pentru toate formele patologice studiate (Fig. 12). Totuşi în variantele solide cu prezenţa unui bogat infiltrat inflamator reactivitatea nu a fost atât de puternică în comparaţie cu formele solide simple. 27
Analiza semicantitativă prin studiul densităţii optice integrate (IOD) a relevat valori net superioare pentru CBC morfeiform, comparativ cu CBC adenoid şi cu CBC solid, care a avut şi o variabilitate mai mare dată de tipurile cu /fără infiltrat inflamator (test ANOVA) (Figura 13). Figura 12. CBC solid imunopozitiv pentru 34βE12. Imunodetecţie cu DAB, x 100 14000 IOD - IHC citokeratine cu masa moleculara mare 12000 10000 IOD 8000 6000 4000 28 2000 0 CBC morfeiform CBC adenoid CBCsolid Figura 13. Analiza semicantitativă a expresiei citokeratinelor cu masă moleculară mare
4.b. Am continuat cu analiza histologică a activităţii proliferative şi apoptotice prin imunomarcare pentru Ki-67 şi caspaza 3 activată. În tipul morfeiform de CBC, celulele apoptotice au coincis cu celulele în degenerare pe care le-am observat încărcate cu keratină în coloraţii uzuale (Fig. 14). Figura 14. CBC morfeiform. Corpi apoptotici, caspazo-pozitivi în centrii de keratinizare. Procent (%) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Indexul proliferativ si apoptotic in CBC CBC adenoid CBC morfeiform CBC solid Apoptoza Mitoza Figura 15. Indexul apoptotic şi proliferativ în CBC. 29
Comparând indexul proliferativ cu cel apoptotic, am observat valori constant mai mari pentru acesta comparativ cu indexul proliferativ (test t student, p<0,05 pentru fiecare pereche în parte) (Fig. 15). 4.c. Examinarea infiltrării cu limfocite a arătat un infiltrat limfocitar de tip B maxim în stroma CBC morfeiform (8,5% ±7,1%), comparativ cu formele adenoid (4,6% ±4,2%) şi solid (5,2% ±4%). Analiza morfometrică semicantitativă (procentuală pe numărul de nuclei de celule stromale) a arătat un infiltrat limfocitar de tip T maxim în stroma peritumorală a CBC morfeiform (88% ±22%), comparativ cu formele adenoid (75% ±15%) şi solid (68% ±11%). 4.d. Studiul expresiei actinei de muschi neted a arătat intensităţi variabile, proporţionale cu un tip histopatologic mai sever al bolii (Fig. 16). 30 Figura 16. Expresie constantă α-sma în celulele bazaloide într-un CBC morfeiform. Imunohistochimie pentru α-sma. În CBC morfeiform expresia α-sma a fost net superioară celei din formele de CBC solid, constant intracitoplasmatic, însă mai slabă ca intensitate şi fără a se
putea identifica membranele celulare. În regiunea profundă a CBC morfeiform, zonă descrisă de altfel cu o puternică reacţie desmoplastică, am putut identifica şi o puternică reactivitate în miofibroblaştii stromali, reacţie cu un pattern citoplasmatic. 4.e. Studiind expresia bcl-2 am putut aprecia că CBC solid a avut intensitatea de marcare maximă, apoi au urmat CBC adenoid şi solid. 5. Studiul morfometric a identificat o descreştere a gradului de fibroză de la CBC morfeiform la cel adenoid şi la cel solid. În paralel cu variaţiile infiltratului inflamator, şi gradul de fibroză a variat în CBC morfeiform la suprafaţa sa comparativ cu profunzimea, astfel explicându-se deviaţia standard largă pentru IOD-CBC morfeiform. Rezultatele au arătat de asemenea o creştere a densităţii nucleare stromale, de la forma solidă la cea adenoidă şi respectiv morfeiformă. S-au înregistrat variaţii largi pentru CBC morfeiform în zonele profunde şi respectiv superficiale, dar per total densitatea nucleară stromală s-a corelat foarte bine cu densitatea colagenă stromală (coeficient Pearson = 0.85, p<0,001). 12 Numarul de vase in functie de distanta de tumora Nr. vase 10 8 6 4 2 0 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91- Interval de distanta (μm) 100 CBC solid CBC adenoid CBC morfeiform Figura 17. Densitatea vasculară în CBC. 31
Analiza distribuţiei vaselor de sânge în stroma peritumorală a arătat că între 30-60 de μm distanţă de plajele de celule epiteloide, numărul de vase a fost maxim, cu nivele mai mici la distanţă sau foarte aproape de tumoră (Fig. 17). Analiza tridimensională a relatiei celule bazaloide cu vasele de sânge şi cu epiteliul suprajacent. Pe serii de câte 50 de secţiuni seriate îmbinate în structuri tridimensionale am observat aceeaşi repartiţie a vaselor de sânge, la periferia insulelor tumorale (Fig. 18), cu relativa lipsă a acestora în ochiurile de ţesut conjunctiv intratumorale, ca de exemplu pentru CBC adenoid. Analiza secţiunilor scanate complet pentru cele trei forme histopatologice cel mai frecvent întâlnite a relevat un contact permanent între plajele de celule bazaloide şi stratul bazal epidermal sau stratul germinativ al firului de păr. Figura 18. Secţiuni seriate şi reconstrucţie 3D a unui CBC adenoid. Vasele nu apar intratumoral în ochiurile de ţesut conjunctiv. 32
Capitolul VI - Discuţii integrează rezultatele studiului în problematica generală a patologiei CBC. Profilul epidemiologic al pacientului cu CBC pe lotul studiat corespunde cu datele din literatură, cu frecvenţele relative întâlnite în cadrul altor studii. În CBC, mitozele pot fi identificate cu uşurinţă în microscopia fotonică, dar cu toate acestea tumora are per ansamblu o rată de creştere foarte scăzută. S-a sugerat astfel că şi rata apoptozei ar trebui să fie cel puţin egală cu indicele proliferativ. În conformitate cu aceste rezultate, şi studiul de faţă a găsit un indice apoptotic semnificativ mai mare decât cel proliferativ, prin compararea expresiei caspzei-3 activate şi a markerului de proliferare Ki-67. Aparent, un indice apoptotic superior celui proliferativ ar duce la dispariţia tumorii şi mai mult nu ar explica şi creşterea sa in timp. Totuşi, date din literatură arată că există o heterogenitate a indicilor de apoptoză-necroză în dinamica tumorii, ca urmare a modulării expresiei unor factori pro- sau anti-apoptotici, ceea ce se explică prin creşterea agresivităţii tumorii date. Studiul nostru a confirmat prezenţa relativă a citokeratinelor cu masă moleculară mare în toate tipurile de CBC studiate, cu absenţa expresiei citokeratinei cu masa moleculară mică CK19. Totuşi am observat că deşi am folosit un anticorp care recunoaşte cel puţin patru citokeratine de masă moleculară mare, reactivitatea a fost inconstantă pentru toate formele histopatologice studiate. De fapt, aceste date se corelează bine cu studii mai noi care arată o mai mare variabilitate a expresiei citokeratinelor în CBC, cu prezenţa selectivă a CK de masă moleculară mare în funcţie de subtipul patologic, şi chiar prezenţa CK19 sau a CK cu masă moleculară mică în general în anumite forme de CBC. Reactia gazdei faţă de invazia tumorală este controlată prin mai multe mecanisme, dintre care cele mediate imun sunt considerate centrale, şi sunt reflectate la nivel tisular prin apariţia unui infiltrat inflamator bogat în limfocite, mastocite, macrofage, celule dendritice, plasmocite, neutrofile şi 33
eozinofile. Studiile iniţiale privind infiltratul inflamator în CBC a arătat predominanţa limfocitelor T, şi se pare că imunitatea celulară este mecanismul de apărare cel mai important şi faţa de aceste tumori. Studiul de faţă, ca şi altele, a demonstrat că, de fapt, infiltratele limfocitare nu se corelează cu indicii apoptotici / proliferativi, dar sunt totuşi crescute în formele mai agresive. În ceea ce priveşte factorii stromali, rezultatele noastre au găsit expresia crescută a actinei de muşchi neted (SMA) în formele histopatologice agresive de CBC, şi în special în CBC morfeiform. Studii foarte recente au făcut aceeaşi observaţie, cuantificând SMA în stroma tumorală. Observaţiile comune au fost că expresia SMA în formele mai puţin agresive este redusă la citoplasma celulelor bazaloide, dar nu şi în stromă. Ineresant, studiul nostru a arătat persistenţa SMA în citoplasma celulelor bazaloide în formele agresive de boală, dar cu o redistribuire membranară sau submembranară a acesteia. Concluzii 1. Profilul epidemiologi al bolnavului cu CBC in Judetul Valcea intre anii 1999-2007 a fost: a. Bărbat b. Interval de varstă: 60-80 de ani c. Mediu de provenienţă urban d. Localizare la nivelul feţei e. Forma clinică predominantă: nodular-ulcerat f. Forma morfologică dominantă: solidă 2. Agresivitatea tumorii descreşte de la tipul infiltrativ, la morfeiform, adenoid şi apoi solid. Acest fapt a fost corelat, si se aseamană cu pattern-ul altor date publicate în literatură. 34
3. Studiul de faţă ilustrează o expresie variabilă a citokeratinelor în CBC. Expresia lor nu se poate incadra deci într-un tipar stabil nici măcar în cadrul aceleiaşi forme morfologice. 4. Infiltratul inflamator cronic este abundent în porţiunea inferioară a tumorii, la joncţiunea cu dermul profund sau hipodermul. Infiltratul limfocitar de tip T este mai intens în stroma tumorală a CBC morfeiform. 5. Indicele apoptotic este superior indicelui de proliferare, şi ambii au valori mai ridicate in formele mai infiltrative. Aceasta se pare că este o trăsătură cheie ce limitează infiltrativitatea tumorii şi creşte proporţional în formele agresive contrabalansând astfel fenotipul mai agresiv celular. 6. Expresia SMA si bcl-2 se corelează cu formele agresive de CBC, fapt confirmat de altfel de date recente în literatură. 7. Necesitatea contactului permanent cu stratul bazal epidermal sau teaca externă a folicului pilos pot aduce pe viitor indicii asupra necesităţii unui posibil micromediu incompatibil cu metastazarea în aceste tumori. 8. În general densitatea vasculară este crescută în jurul tumorii, dar nu în contact direct cu aceasta. Pe viitor ar fi interesant de evaluat ce semnale moleculare blochează apropierea vasculară de tumoră. 35
CURRICULUM VITAE NUME DATA NAŞTERII Alexandru Pirici 15 septembrie 1947, Com. Copăceni, Jud. Valcea AFILIAŢIA CURENTĂ Spitalul Judeţean Rm. Vâlcea, Jud. Vâlcea medic primar dermatolog PUBLICAŢII Lucrări prezentate Modalităti actuale de educaţie sanitară şi testarea eficienţei lor. D. Muresan, E. Robu, N. Mitea, I. Leo Miza, F. Fraer (Suceava), M. Chiriac (Falticeni), I. Cotescu, S. Teleki, A. Pirici. Sesiunea stiintifica a centrului dermato venerologic, Rm. Valcea 1987. Consideratii asupra cancerului mamar in jud. Valcea in perioada 1981-1982. Elena Pirici, A.Pirici, Gh.Ristescu, Maria Timofte. Simpozionul Romano-German de obstreetica-ginecologie Sibiu 1994 Benign-malign, semnificaţie diagnostică şi conduită terapeutică în adenopatia periferică. E. Pirici, A. Pirici, M. Timofte, C. Popescu, Congresul Naţional de Oncologie, Bucureşti, 1994 Corelaţia dintre markerii antigenici tumorali şi evoluţia bolii neoplazice. Elena Pirici, A. Pirici, A. Lazarescu, ND. Pirici. Conferinta Nationala de Oncologie, Bucuresti, 19-20 noiembrie 1998. Studiul eficacităţi combinaţiei navelbine cu cisplatin în tratamentul neoplasmului mamar avansat. E. Pirici, A. Pirici, I. Prioteasa, N. D. Pirici, I.Tarcobu. Prima conferinta nationala de oncologie medicala, Craiova Caciulata, 11-14 aprilie 2002. 36
Fiziopatologia metastazelor osoase, indicatii terapeutice. Elena Pirici, A.Pirici, Nicoleta Munteanu, A 6-a Conferinta Nationala de oncologie medicala.gura Humorului 18-21 oct 2007 Studiu retrospectiv al metastazelor osoase in jud.valcea. Elena Pirici, A.Pirici, Ioana Tircobu, M.Vultur, D.Stoica, A. Carmen Jinaru. Zilele Medicale Valcene 12-14 ian. 2007 Falsa reactie alergica la doxiciclina. A. Pirtici,Elena Pirici, Ionica Pirici. Zilele Medicale Valcene 12-14 ian 2oo7 Mecanismele metestazarii in cancerul mamar si bronho-pulmonar. Elena Pirici, Ionica Pirici, A.Pirici, N.D.Pirici, Nicoleta Munteanu. Zilele Medicale Valcene 15-17 mai 2009 Morfopatologia carcinomului bazocelular. A.Pirici, Elena Pirici, Ionica Pirici, N.D.Pirici. Zilele Medicale Valcene 15-17 mai 2009 Eritrodermie la derivatii de carboxamida. A.Pirici, Elena Pirici, Ionica Pirici, N.D.Pirici. Zilele Medicale Valcene 15-17 mai 2009 Carcinomul bazocelular investigatii imunohistochimice. A Pirici, F Bogdan, Elena Pirici. Al VIII-lea Simpozion Naţional al Societăţii Române de Morfologie, Craiova, mai 26-30 2009 Aspecte imunohistochimice in carcinomul ductal invaziv. Elena Pirici, F. Badulescu, A. Pirici, Raluca Marinas, Emilia Patru. Al VIII-lea Simpozion Naţional al Societăţii Române de Morfologie, Craiova, mai 26-30 2009 Studiul clinico-statistic si histologic al carcinomului bazocelular in judetul Valcea in perioada 1999-2007 A.Pirici, Elena Pirici, Ana Soria Zaharie, V.Pirci. Zilele Medicale Valcene 7-9 mai 2010 Exantemele in practica medicala curenta A.Pirici, Elena Pirici, V.Pirici. Zilele Medicale Valcene 7-9 mai 2010 Terapia metastazelor osoase Elena Pirici, A.Pirici, Nicoleta Munteanu, Fl.Badulescu. Zilele Medicale Valcene 7-9 mai 2010 37
Xeloda in cancerul de sân-prezentare de caz Elena Pirici, A.Pirici, Fl.Badulescu. Al IX-lea Simpozion Naţional al Societăţii Române de Morfologie, Craiova, mai 26-29 2010 Analiza epidemiologica si histologica a carcinomului bazocelular in Judetul Valcea in perioada 1999-2007. A. Pirici, Elena Pirici, Zaharie Ana-Sorina, F. Bogdan. Al IX-lea Simpozion Naţional al Societăţii Române de Morfologie, Craiova, mai 26-29 2010 Lucrări publicate in extenso Immunohistochemical nuclear staining for p53, PCNA, Ki-67 and bcl- 2 in different histologic variants of basal cell carcinoma. Mateoiu, C., Pirici, A., Bogdan, F. Rom J Morphol Embryol. 52(1 Suppl):315-9319; 2011 Revista indexata ISI, cu FI=0.4 Assesment of cell proliferation/death balance and inflammation in different histological variants of basal cell carcinoma. Pirici, A., Pirici, E., Voinescu, D., Cruce, M., and Bogdan, F. Annals of RSCB XVI, 254-260; 2011 Revista cotata CNCSIS B + The early diagnosis of the esophagogastric junction adenocarcinomas. Voinescu, D-C., Bârcă, A., Cioboată, E., Cimpoieru, A., Pirici, A., Cruce, M. Annals of RSCB XVI, 242-249; 2011 Revista cotata CNCSIS B + Vertebral bone metastasis in breast cancer: a case report. Pirici E, Pirici A, Pătrană N, Recăreanu F, Bădulescu F, Crişan AE, Zaharie AS. Rom J Morphol Embryol. 52(3):897-905; 2011 Revista indexata ISI, cu FI=0.4 38