Annals of Oncology 25: , 2014 doi: /annonc/mdu145 A doua conferință consensuală a ESMO pentru cancerul pulmonar: anatomie patologică și

Annals of Oncology 25: 1681 1690, 2014 doi:10.1093/annonc/mdu145 A doua conferință consensuală a ESMO pentru cancerul pulmonar: anatomie patologică și biomarkeri moleculari în cancerul pulmonar fără celule mici K. M. Kerr 1*, L. Bubendorf 2, M. J. Edelman 3, A. Marchetti 4, T. Mok 5, S. Novello 6, K. O Byrne 7,8, R. Stahe l9, S. Peters 10, E. Felip 11 și membrii comitetului *, 1 Department of Pathology, Aberdeen Royal Infirmary and Aberdeen University Medical School, Aberdeen, Marea Britanie; 2 Institute for Pathology, University Hospital Basel, Basel, Elveția; 3 University of New Mexico Cancer Center, Albuquerque, SUA; 4 Center of Predictive Molecular Medicine, Center of Excellence on Ageing, University-Foundation, Chieti, Italia; 5 Department of Clinical Oncology, Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, Shatin New Territories, Hong Kong, China; 6 Thoracic Oncology Unit, Department of Oncology, University of Turin, Azienda Ospedaliero-Universitaria San Luigi Orbassano, Italia; 7 Trinity College, Dublin, Irlanda; 8 Queensland University of Technology, Brisbane, Australia; 9 Clinic of Oncology, University Hospital Zürich, Zürich; 10 Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV), Lausanne, Elveția; 11 Medical Oncology, Vall d Hebron University Hospital, Barcelona, Spania Primit la 14 noiembrie 2013; revizuit la 28 februarie 2014; acceptat la 31 martie 2014 În scopul completării ghidurilor terapeutice existente pentru toate tipurile tumorale, ESMO organizează conferințe consensuale care se concentrează asupra unor aspecte specifice pentru fiecare tip tumoral. A 2-a Conferință Consensuală a ESMO pentru Cancerul Pulmonar s-a desfășurat în perioada 11 12 mai 2013 în Lugano. S-au întrunit în total 35 de experți pentru a aborda mai multe întrebări despre cancerul pulmonar fără celule mici (NSCLC, non-small-cell lung cancer) din fiecare dintre cele patru domenii: anatomopatologie și biomarkeri moleculari, boala în stadiu precoce, boala avansată local și boala avansată (metastatică). Pentru fiecare întrebare au fost stabilite recomandări care au inclus referințe privind gradele de recomandare și nivelurile de evidență. Această lucrare consensuală se concentrează asupra recomandărilor cu privire la anatomia patologică și biomarkerii moleculari în relație cu diagnosticul de cancer pulmonar, în principal cu cel de carcinom fără celule mici. Cuvinte cheie: ESMO, consens, cancer pulmonar fără celule mici, anatomie patologică, testare moleculară, recomandări Cancerul pulmonar reprezintă principala cauză de deces prin cancer, iar majoritatea agenților de chimioterapie utilizați în prezent nu au o specificitate și o eficacitate adecvată. În ultimul deceniu a fost introdus aspectul histologic (tipul cu celule scuamoase comparativ cu tipul fără celule scuamoase) ca factor determinant important al terapiei în carcinomul fără celule mici (NSCLC). În plus, o proporție semnificativă a pacienților au tumori cu caracteristici moleculare care pot fi țintite terapeutic (mutații, gene de fuziune etc.) [1] și, în *Adresă de corespondenţă: ESMO Guidelines Working Group, ESMO Head Office, Via L. Taddei 4, CH-6962 Viganello-Lugano, Elveţia; E-mail: clinicalguidelines@esmo.org Vezi Anexa pentru lista membrilor comitetului The Author 2014. Publicat de Oxford University Press din partea European Society for Medical Oncology. Toate drepturile sunt rezervate. Pentru permisiuni, vă rugăm să trimiteţi email la: journals.permissions@oup.com prezent, marea majoritate a acestor anomalii moleculare asupra cărora se poate acționa apar în adenocarcinoamele pulmonare. Testele de laborator pentru identificarea pacienților care ar putea răspunde la aceste terapii țintite, pe baza unui biomarker predictiv, reprezintă o schimbare de paradigmă în diagnosticul cancerului pulmonar și, în prezent, au devenit un standard de îngrijire [2 6]. Sunt în curs de investigare țintele potențiale identificate mai frecvent în carcinomul cu celule scuamoase. Diagnosticul anatomopatologic de cancer pulmonar reprezintă în prezent un proces cu mai multe etape, începând cu diagnosticul morfologic pentru determinarea tipului histologic, perfecționat prin imunohistochimie (IHC) atunci când este cazul (vezi Recomandarea 2), urmat de o caracterizare moleculară adecvată a tumorii.

doi:10.1093/annonc/mdu145 2 Acest algoritm de diagnostic din ce în ce mai complex implică mai multe provocări pentru persoanele implicate în managementul pacienților cu cancer pulmonar [1 7]. Dintre acestea, este importantă disponibilitatea unei cantități suficiente de țesut tumoral pentru efectuarea tuturor testelor necesare. Majoritatea NSCLC sunt diagnosticate în stadiu avansat și, prin urmare, eșantioanele tumorale mari (de exemplu, obținute în urma rezecției chirurgicale) sunt disponibile în puține cazuri. La pacienții cu boală avansată, intervențiile necesare pentru obținerea țesutului tumoral sunt adesea dificile din cauza localizării tumorii și a comorbidităților pacientului și, prin urmare, majoritatea eșantioanelor obținute în cancerul pulmonar sunt foarte mici, cu un conținut tumoral minim. În prezent este obligatoriu ca, oricând este posibil și fără afectarea siguranței pacientului, orice biopsie în scop diagnostic sau procedură de prelevare a unui eșantion tisular să aibă scopul de a preleva o cantitate cât mai mare de țesut [3]. Rolul unei echipe multidisciplinare, care să includă chirurgi toracici, radiologi, anatomopatologi, oncologi și pneumologi, este esențial pentru determinarea celei mai bune abordări pentru fiecare pacient în parte. Eșantioane tisulare din tumora primară pot fi obținute prin bronhoscopie, chirurgie toracoscopică video-asistată, toracotomie sau prin tehnici ghidate imagistic, percutane, transtoracice, transbronșice sau transesofagiene [3, 7]. Unele dintre aceste abordări, precum și multe alte intervenții prin care sunt accesate localizările extratoracice, pot fi alese, după caz, pentru prelevarea de eșantioane în boala metastatică. În prezent nu există dovezi care să sugereze că ar exista diferențe semnificative în privința relevanței clinice a testelor pentru biomarkeri efectuate la nivelul tumorii pulmonare primare comparativ cu orice alte metastaze determinate de aceasta. Alegerea locului din care vor fi prelevate eșantioane va fi determinată de obicei de facilitatea accesului, de siguranța pacientului și de țesutul care poate fi obținut. Eșantioanele tisulare variază, de la tumora în întregime sau părți mari din aceasta până la biopsii tisulare mai mici și cu o varietate de eșantioane conform tipului citologic. Rezultatul oricărei proceduri variază în funcție de natura tehnicii utilizate (chirurgie deschisă, închisă, ghidată imagistic etc.), de echipamentul utilizat (diametrul sau tipul acului de recoltare etc.) și de abilitățile și perseverența persoanei care efectuează prelevarea. Eșantioanele de biopsie tisulară și cele pentru evaluarea tipului citologic sunt adecvate pentru stabilirea diagnosticului și testarea moleculară, dar trebuie să fie manipulate în mod adecvat pentru a facilita procedurile necesare pentru diagnosticul molecular. Aceste ghiduri le urmează celor publicate în anul 2011 [8]. Pentru următoarele recomandări, nivelurile de evidență și gradele de recomandare au fost aplicate cu ajutorul sistemului prezentat în Tabelul 1. Afirmaţiile fără grade alocate au fost considerate practica clinică standard de către experţii şi comitetul ESMO. Tabelul 1. Nivelurile de evidență și gradele de recomandare [adaptat după Infectious Diseases Society of America-United States Public Health Service Grading System [98] (cu permisiunea Infectious Diseases Society of America)] Niveluri de evidenţă I. Evidenţe din cel puţin un studiu mare, randomizat, controlat, cu calitate metodologică bună (potenţial scăzut de eroare sistematică) sau din meta-analizele unor studii randomizate bine efectuate fără heterogenitate II. Studii randomizate mici sau studii randomizate mari cu o suspiciune de eroare sistematică (calitate metodologică mai redusă) sau meta-analizele acestor studii sau ale unor studii cu heterogenitate demonstrată III. Studii de cohortă prospective IV. Studii de cohortă retrospective sau studii caz-control V. Studii fără grup de control, cazuri clinice izolate, opiniile experților Grade de recomandare A. Evidenţe solide ale eficacităţii cu un beneficiu clinic substanţial, puternic recomandat B. Evidențe puternice sau moderate ale eficacității, dar cu un beneficiu clinic limitat, în general recomandat C. Evidenţe insuficiente ale eficacităţii sau beneficiul nu depăşeşte riscul sau dezavantajele (evenimente adverse, costuri ), opţional D. Evidenţe moderate împotriva eficacităţii sau ale unor rezultate nefavorabile, în general nerecomandat E. Evidenţe puternice împotriva eficacităţii sau ale unor rezultate nefavorabile, nu este niciodată recomandat Recomandarea 1: Ghiduri privind manipularea eșantioanelor tisulare Procesarea eșantionului Este recomandată fixarea standard cu ajutorul unei soluții 10% de formalină neutră tamponată (4% formaldehidă) [V, A] Timpul de fixare nu trebuie să fie mai mic de 6 ore și nu trebuie să depășească 48 de ore [IV, A] În mod ideal, secțiunile pentru testarea biomarkerilor trebuie să fie efectuate imediat înaintea analizei [IV, A] Eșantioanele citologice (blocuri celulare, frotiuri directe colorate sau preparate în mediu lichid) pot fi utilizate în mod fiabil pentru detectarea mutațiilor EGFR și a rearanjărilor ALK [III, A]. În acest moment, blocul celular reprezintă sursa celulară cu cea mai largă aplicabilitate Dacă este posibil, același anatomopatolog trebuie să reanalizeze toate materialele tumorale disponibile prelevate de la un anumit pacient, inclusiv biopsii și eșantioane citologice, pentru alegerea eșantionului care este cel mai adecvat pentru analiza biomarkerilor [IV, A] Un anatomopatolog trebuie să fie implicat în prepararea eșantionului pentru extragerea ADN [V, A] Este recomandată îmbogățirea eșantioanelor prin micro-

3 Kerr et al sau macrodisecție pentru maximizarea conținutului de celule tumorale înainte de extragerea ADN [III, A] Factorii preanalitici sunt esențiali pentru testarea corectă a biomarkerilor pe orice eșantion pentru diagnostic, însă standardizarea procesării tisulare rămâne o provocare. Timpul până la fixare (timpul de ischemie la rece) trebuie să fie redus la minimum, ideal la numai câteva minute, și în mod cert trebuie să fie mai mic de o oră pentru a evita degradarea proteinelor și a acizilor nucleici (AN) [9, 10]. Fixarea inhibă descompunerea sau autoliza celulelor și conservă morfologia tisulară. Eșantioanele trebuie să fie fixate cu soluție de 10% de formalină neutră tamponată (soluție de formaldehidă 4%), care este disponibilă pe scară largă și care conservă proteinele, ARN și ADN pentru analiza ulterioară a biomarkerilor. În general, perioada de fixare trebuie să fie între 6 și 48 de ore [3, 11]. Un timp de fixare mai mare sau mai mic poate afecta în mod negativ calitatea IHC, a hibridizării in situ (HIS) și a testării mutațiilor; de asemenea, fixarea insuficientă determină afectarea morfologiei tisulare [3, 12]. În cazul în care se recurge la o rutină de procesare rapidă cu un timp scurt de fixare, trebuie să se țină cont de aceste riscuri, iar rezultatele trebuie să fie interpretate cu grijă. Fixatorii acizi (de exemplu, Bouin) nu sunt recomandați deoarece determină degradarea rapidă a AN [13], iar fixarea accelerată cu formalină încălzită este descurajată, deoarece aceasta degradează morfologia și afectează studiile moleculare [14]. Dacă este posibil, ar trebui evitată utilizarea pentru analiza moleculară a eșantioanelor obținute din metastaze osoase care au fost decalcificate cu agenții acizi despre care se știe că degradează ADN. Acidul etilendiamintetraacetic este un agent eficace de decalcificare, nu are un efect negativ asupra calității ADN-ului și trebuie să fie utilizat pentru eșantioanele prelevate în cazul suspiciunii de cancer pulmonar, care necesită decalcificare și pentru care se anticipează necesitatea efectuării unor teste moleculare. La nivelul secțiunilor tisulare fixate cu formalină și incluse în parafină, trecerea timpului determină degradarea epitopilor și a ADN-ului. Secțiunile trebuie să fie proaspăt tăiate, iar analiza biomarkerilor trebuie să fie efectuată în 4-6 săptămâni pentru a evita rezultatele neconcludente sau cele fals negative. Integritatea secțiunilor tisulare păstrate poate fi prelungită prin acoperirea cu parafină sau prin etanșarea cu ajutorul unor benzi speciale [3, 13]. Până la 40% dintre toate diagnosticele de NSCLC sunt stabilite numai pe baza citologiei. Analizele biomarkerilor pot fi aplicate eșantioanelor citologice, care pot include blocuri celulare, frotiuri, materiale de citocentrifugare sau citologie în mediu lichid [15]. Blocurile celulare sunt preferate de multe instituții pentru analiza markerilor deoarece pot fi utilizate aceleași protocoale ca și în testarea histologică. De asemenea, fixarea pe bază de etanol a frotiurilor citologice permite analiza mutațiilor, hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) și IHC, deși anatomopatologii trebuie să conștientizeze faptul că protocoalele de laborator pot fi foarte diferite de cele utilizate pentru țesuturile fixate cu formalină [3, 15 17]. Aceiași factori preanalitici (timpul până la fixare, timpul de fixare și îmbătrânirea materialului) pot fi aplicați și în cazul eșantioanelor citologice. Dacă este posibil, același anatomopatolog, preferabil cu experiență în cancerul pulmonar, ar trebui să analizeze toate materialele disponibile pentru un anumit pacient, pentru alegerea celor care sunt optime pentru analiză. Aceasta va include reperarea unor secțiuni pentru macro/microdisecție după caz (vezi mai jos). Atunci când eșantioanele de citologie și biopsie sunt raportate în mod independent, este încurajată o comunicare strânsă între anatomopatologii responsabili pentru a facilita cea mai bună selecție a eșantioanelor. De asemenea, anatomopatologii sunt responsabili pentru instruirea și supravegherea personalului tehnic care prepară și procesează eșantioanele înaintea analizei moleculare. De obicei, pentru testarea biomarkerilor pe baza ADN sau ARN, este importantă îmbogățirea conținutului de celule tumorale al țesutului utilizat pentru extragerea AN. Secțiunile tisulare cu un conținut tumoral înalt pot fi utilizate direct. În eșantioanele mai sărace, atunci când este posibil, regiunile adecvate identificate de anatomopatolog pot fi raclate (prin macrodisecție manuală) de pe lamele tisulare. Microdisecția prin captură laser poate facilita un grad înalt de purificare a tumorii pentru extragerea AN, chiar și în cazul eșantioanelor foarte sărace, însă această tehnologie nu este disponibilă pe scară largă și necesită o serie de abilități ale anatomopatologului, iar munca și costurile suplimentare implicate trebuie să fie puse în balanță cu posibilitatea de a repeta biopsia. Recomandarea 2: Care este rata acceptabilă a diagnosticului de NSCLC fără altă specificație (FAS) în condițiile unui material mic de diagnostic bioptic/ citologic și cum se poate obține aceasta? Diagnosticul de NSCLC-FAS trebuie să fie stabilit în <10% din cazuri [IV, A] Această cifră este obținută prin utilizarea rațională a imunohistochimiei în cazurile incerte din punct de vedere morfologic. O abordare recomandată ar trebui să includă TTF-1 pentru anticiparea prezenței adenocarcinomului. Pentru anticiparea prezenței carcinomului cu celule scuamoase, sunt utile testarea p63 sau a p40 și a CK5/6 [IV, A] Stabilirea unui diagnostic histologic specific (carcinom scuamos comparativ cu adenocarcinom) este importantă în stabilirea deciziilor terapeutice. Medicamente ca pemetrexed și bevacizumab sunt aprobate numai pentru utilizarea la pacienții cu NSCLC nescuamos, pe baza eficacității și, respectiv, a toxicității [18, 19]. Triajul recomandat al

doi:10.1093/annonc/mdu145 4 Tabelul 2. Terminologia recomandată pentru diagnosticul cancerului pulmonar pe eșantioane mici Carcinom cu celule mici Carcinom cu celule scuamoase NSCLC, probabil carcinom cu celule scuamoase Adenocarcinom NSCLC, probabil adenocarcinom NSCLC-FAS a Tumoră carcinoidă b Altele c a Acest diagnostic este încă acceptabil în cazul în care nu poate fi efectuată testarea imunohistochimică (IHC) sau dacă aceasta nu are rol predictiv, situație denumită IHC invalidă. b Nu se poate efectua în mod corect diferența dintre tumorile carcinoide tipice și atipice pe eșantioane mici. c Rareori, de exemplu, poate exista o cantitate suficientă de țesut și trăsături morfologice care să permită diagnosticarea cu exactitate a unor tumori rare cum sunt carcinomul adenoid chistic sau mucoepidermoid. tumorilor selecționate pentru testarea moleculară se face parțial pe bază histologică. Criteriile de diagnostic din clasificarea OMS a carcinoamelor pulmonare [20] necesită examinarea întregii tumori. Totuși, majoritatea cancerelor pulmonare nu sunt rezecate chirurgical, iar diagnosticul, clasificarea și testarea biomarkerilor moleculari sunt efectuate pe eșantioane mici de biopsie în scop diagnostic sau pe eșantioane pentru stabilirea tipului citologic (vezi mai sus). Absența criteriilor de diagnostic aplicabile și tendința anatomopatologilor de a stabili diagnosticul pe baza unor dovezi inadecvate probabil că sunt responsabile pentru lipsa de exactitate care a fost raportată în legătură cu clasificarea morfologică a subtipurilor NSCLC pe eșantioane mici [21 28]. NSCLC pentru care nu există dovezi morfologice clare pentru diferențierea tipurilor scuamos sau glandular într-un eșantion tumoral mic trebuie să fie clasificate ca NSCLC-FAS [21, 28]. Aceste cazuri NU trebuie să fie clasificate în categoria de carcinom cu celule mari [29, 30]. Ratele raportate ale NSCLC-FAS sunt foarte variabile, ceea ce reflectă variațiile abordării anatomopatologice și cazurile diferite din studiile publicate, însă probabil că ratele de 25% 30% din eșantioanele mici de biopsie și până la 40% în eșantioanele pentru stabilirea tipului citologic reflectă o situație din lumea reală pentru cazuri consecutive, neselecționate. IHC predictivă poate reduce rata NSCLC-FAS la <10%, în mod tipic la 5% 6%, dar niciodată la zero. Majoritatea diagnosticelor de NSCLC-FAS sunt rezultatul unor eșantioane nereprezentative din cancerele pulmonare diferențiate, în principal adenocarcinoame [22]. Markerii ca p63, p40 și citokeratina CK 5/6 sunt asociați cu carcinoamele cu celule scuamoase, iar TTF1, Napsin A și CK7, precum și colorația pentru mucină, sunt asociați cu adenocarcinoamele [31 36]. Totuși, acești markeri nu sunt specifici pentru formularea unui anumit diagnostic. TTF1 este exprimat numai în 75% 80% dintre adenocarcinoamele pulmonare. Acești markeri au numai valoare predictivă atunci când sunt exprimați în anumite niveluri în eșantionul de diagnostic; aceste niveluri au fost determinate pe baza puterii predictive pentru eșantioanele mici în comparație cu diagnosticul final pe baza rezecției [31 33]. În cazul în care este anticipat un subtip al NSCLC prin această abordare, diagnosticul recomandat este de NSCLC, probabil (sau cu aspect favorabil pentru) carcinom cu celule scuamoase sau probabil adenocarcinom. Exactitatea predictivă este de ~85%. Prin urmare, în eșantioanele mici de biopsie sau citologie, trebuie stabilită o gamă mai limitată de diagnostice de carcinom primar (Tabelul 2) [29, 30]. Cazurile cu un diagnostic favorabil pentru... trebuie să fie tratate ca și cele cu un subtip clar stabilit. Recomandarea 3: A fost recomandată testarea de rutină a mutațiilor somatice ale EGFR Toate tumorile nescuamoase ale pacienților cu boală avansată/recurentă trebuie să fie testate pentru identificarea mutațiilor EGFR [I, A] Tumori scuamoase selecționate (de la pacienți cu antecedente de fumat minime sau îndepărtate) trebuie să fie în mod clar luate în considerare pentru testare [IV, B] Este puternic încurajată o acoperire largă a mutațiilor de la nivelul exonilor 18 21, inclusiv a celor asociate cu rezistența la unele terapii. La un nivel minim, în cazul în care resursele sau materialele sunt limitate, trebuie să fie determinate cele mai frecvente mutații activatoare (Exon19del, L858R) [I, A] Orice metodologie utilizată trebuie să fie validată printr-un program extern de asigurare a calității [V, A] Mutațiile activatoare ale domeniului tirozin kinazic al genei receptorului factorului de creștere epidermală (EGFR, epidermal growth factor receptor) sunt identificate în 10% 16% din cazurile de adenocarcinom ale pacienților din Europa [37 39]. Aceste mutații sunt raportate doar rareori în carcinomul cu celule scuamoase clar demonstrat. Cauza mutațiilor EGFR este necunoscută, dar nu este asociată cu procesul de carcinogeneză determinat de tutun. Prin urmare, aceste mutații sunt mai frecvente la pacienții care nu au fumat niciodată sau au fost fumători în trecutul îndepărtat și la femeile mai tinere, fără a fi în niciun caz limitate la acești pacienți [40, 41]. Prin urmare, acești parametri clinici nu trebuie să fie utilizați în procesul de selecție a pacienților pentru testarea mutațiilor EGFR. Totuși, dovezi anecdotice recente indică faptul că pacienții cu orice tip de carcinom primar pulmonar, inclusiv carcinom cu celule mici, cu antecedente de fumat minime sau îndepărtate, trebuie să fie luați în mod clar în considerare pentru testare. Studiile de fază III care au inclus pacienți din Asia, Europa și America de Nord cu boală metastatică ale căror tumori prezintă mutații activatoare ale EGFR au demonstrat rate de răspuns înalte (~70%) și o prelungire semnificativă

5 Kerr et al a supraviețuirii fără progresia bolii (SFP) (dar nu și ale supraviețuirii globale) la pacienții tratați cu inhibitori ai tirozin kinazei EGFR (ITK EGFR, gefitinib, erlotinib, afatinib) ca tratament inițial comparativ cu cei tratați prin chimioterapie [42 46]. În prezent, utilizarea ITK EGFR este bine stabilită în practica clinică și necesită testarea de rutină a mutațiilor EGFR în cazurile adecvate. Majoritatea mutațiilor EGFR semnificative clinic sunt reprezentate de delețiile exonului 19 sau de mutația de substituție L858R (80% 90% dintre mutații) [47, 48], însă și mutațiile mai rare de la nivelul exonilor 18 și 21 pot anticipa răspunsul la ITK EGFR. Unele strategii de testare a mutațiilor pot avea specificitate pentru anumite alele într-un interval predeterminat sau pot detecta numai anumite tipuri de mutații (de exemplu, analiza dimensiunii fragmentelor pentru delețiile exonului 19), în timp ce alte tehnici pot detecta orice mutație la nivelul exonilor 18-21 ai EGFR. Metodologia utilizată va depinde adesea de cea disponibilă în fiecare centru. Utilizatorii trebuie să fie conștienți de limitele acoperirii mutațiilor determinate de tehnologia utilizată, precum și de sensibilitatea detectării mutațiilor comparativ cu un genom de bază cu tipul sălbatic (vezi secțiunea de concluzii). De asemenea, aceleași precauții se aplică în utilizarea anticorpilor specifici mutațiilor EGFR în IHC pentru detectarea mutațiilor EGFR. Din cauza mutațiilor importante clinic care nu pot fi detectate cu exactitate de anticorpii disponibili în prezent, această abordare nu este recomandată ca metodă primară de detectare. Unele mutații, în special cele de la nivelul exonului 20, cel mai frecvent inserțiile de la nivelul exonului 20 și substituția T790M, sunt activatoare, dar conferă rezistență la tratamentul de linia întâi cu ITK EGFR [48]. Aceste mutații sunt mai puțin frecvente, dar pot exista sub formă de clone minore în tumorile netratate anterior cu ITK EGFR, care pot fi detectate numai prin metode țintite cu sensibilitate foarte înaltă. Mutația T790M este identificată la ~50% dintre tumorile care recidivează pe parcursul terapiei cu ITK EGFR [49]. În ceea ce privește rezistența la ITK EGFR, strategia de testare este încă în curs de dezvoltare, dar probabil că recomandările specifice pentru testarea mutațiilor T790M vor evolua deoarece în acest context s-a raportat activitatea agenților care țintesc această mutație, precum și mutațiile de sensibilizare mai frecvente. Recomandarea 4: Există dovezi suficiente pentru a susține testarea de rutină a rearanjărilor ALK? Toate tumorile nescuamoase de la pacienți cu boală avansată/recidivată trebuie să fie testate pentru identificarea rearanjărilor ALK [II, A] Tumorile scuamoase selecționate (de la pacienți cu antecedente de fumat minime sau îndepărtate) trebuie să fie în mod clar luate în considerare pentru testare [III, B] Evaluarea definitivă a rearanjărilor ALK este determinată de FISH [I, A] Metodele de IHC pot fi utilizate pentru screening și vor putea fi validate pentru terapie [IV, B] Metodologia utilizată ar trebui să fie validată de un program extern de asigurare a calității [V, A] Rearanjările genei ALK apar în ~3% 5% dintre adenocarcinoame și anticipează răspunsul la inhibitorii țintiți ai ALK. Tumorile cu rearanjări ALK sunt asociate cu trăsături clinico-patologice distincte, printre care debutul la vârstă tânără, antecedente absente sau minore de fumat și prezența adenocarcinomului, în special cu aspect histologic cu inel cu pecete sau acinar [50 55]. Totuși, ca și în cazul mutațiilor EGFR, aceste trăsături clinico-patologice au o sensibilitate insuficientă pentru a permite screeningul în cazul testării unui anumit pacient deoarece o proporție semnificativă a tumorilor cu rearanjări ALK pot rămâne nedetectate. Rearanjările genei ALK sunt foarte rare în carcinomul cu celule scuamoase [50, 51, 55], au fost raportate în carcinomul adenoscuamos [54] și, în mare parte, se exclud reciproc cu mutațiile EGFR sau KRAS [56]. Inhibitorul tirozin kinazei ALK crizotinib este eficace la pacienții ale căror tumori prezintă o rearanjare a genei ALK. În Europa, crizotinib este indicat în prezent pentru terapia de linia a doua la pacienții cu NSCLC care au primit un regim anterior pe bază de platină. În prezent nu există indicații pentru boala precoce sau ca terapie de linia întâi în boala avansată. Prin urmare, testarea ALK nu va fi neapărat necesară în momentul stabilirii diagnosticului, dar ar putea fi efectuată prin prisma anticipării utilității acesteia pe viitor. În majoritatea cazurilor, are loc o fuziune între ALK și ML4 printr-un mic eveniment de inversiune intracromozomială, iar analiza FISH pentru detectarea inversiunilor de la nivelul cromozomului 2 și a altor translocații ale ALK reprezintă în prezent instrumentul standard pentru diagnosticul rearanjărilor ALK. Food and Drug Administration (FDA) din SUA impune utilizarea kitului ALK Break Apart FISH Probe ca dispozitiv de diagnostic companion pentru tratamentul cu crizotinib în cancerul pulmonar [57], însă Agenția Europeană a Medicamentului are reguli mai puțin specifice și solicită numai un test validat pentru ALK [58]. Testarea FISH este relativ costisitoare și poate fi dificil de interpretat, deoarece modificarea cea mai frecventă, inversiunea intracromozomială, determină modificări discrete cu un risc consecutiv de rezultate fals negative și fals pozitive [59]. Detectarea prin IHC a nivelurilor crescute ale proteinei ALK în celulele tumorale cu rearanjări ale ALK oferă o abordare practică și cost-eficientă de prescreening al cazurilor pentru confirmarea prin analiză FISH, pe baza probabilității înalte de prezență a rearanjărilor în cazul în care rezultatul testării IHC este pozitiv și cu o probabilitate foarte redusă de prezență a rearanjărilor ALK în cazul în care rezultatele testării IHC sunt negative [16, 60 64]. Nivelurile proteinei sunt relativ scăzute, iar

doi:10.1093/annonc/mdu145 6 detectarea acesteia necesită un anticorp cu afinitate înaltă și un sistem sensibil de detectare prin IHC. Potențialul IHC ca instrument de screening sau chiar ca biomarker primar este în plină evoluție. Prescreeningul prin IHC este acceptat pe scară largă și este implementat în multe centre. Au fost publicate recomandări pentru utilizarea acestor metode [65, 66]. Recomandarea 5: Avem nevoie de ghiduri pentru testarea altor mutații genetice somatice sau a altor modificări genetice care pot fi țintite (KRAS, BRAF, HER2, fuziunea ROS1, fuziunea RET etc.) În prezent nu este recomandată testarea de rutină a acestor biomarkeri [III IV, C] Pacienții cu variabile demografice (de exemplu, antecedente de fumat minime sau îndepărtate) ale căror tumori au prezentat rezultate negative la testele pentru mutațiile EGFR și pentru rearanjările ALK pot fi luați în considerare pentru testarea pentru rearanjările ROS1, rearanjările RET, mutațiile BRAF și alte modificări pentru care sunt disponibili în prezent agenți terapeutici specifici, chiar dacă dovezile despre activitatea acestora provin din serii de caz (vezi în text) [III, A] Datele emergente din studiile clinice ale agenților cu acțiune țintită în tumori cu alte tipuri de modificări pot duce la recomandări de testare suplimentară Revoluția înregistrată în domeniul analizei genelor și a altor biomarkeri a dus la identificarea mai multor biomarkeri pentru care au fost deja aprobați agenți potențial activi pentru alte indicații (de exemplu, crizotinib pentru rearanjările genei ALK). Acești biomarkeri includ rearanjările genelor ROS1 și RET, amplificarea și mutațiile HER2, mutațiile BRAF și altele [4, 67, 68]. În plus, deși nu a fost dovedit clinic niciun agent activ, analiza mutațiilor KRAS a devenit mai frecventă, datorită disponibilității pe scară largă a testelor validate. Expresiile MET și PDL1 reprezintă alți biomarkeri potențiali. Deoarece niciunul dintre agenții țintiți care acționează la aceste niveluri nu a fost aprobat de către autoritățile de reglementare, nu este recomandată testarea de rutină. Totuși, serii de caz prospective au demonstrat beneficii pentru pacienți (în privința răspunsului și a prelungirii SFP) în cazul tratamentului cu crizotinib, precum și al celui cu vemurafenib și dabrafenib, în tumorile cu rearanjări ale ROS1 și, respectiv, cu mutații BRAF. Prin urmare, membrii comitetului au considerat că testarea pacienților cu un risc important de apariție a unor modificări, în cazul în care acest risc poate fi identificat (de exemplu, antecedente de fumat absente, reduse sau îndepărtate fără anomalii ale EGFR sau ALK), este justificată în cazul în care este utilizată o strategie de testare secvențială [68 70]. Membrii comitetului recunosc că există din ce în ce mai multe dovezi că antecedentele semnificative de fumat nu exclud posibilitatea de existență a unor mutații/rearanjări activatoare, la nivelul cărora se va putea acționa, în special mutațiile BRAF. Această populație poate fi îmbogățită suplimentar prin excluderea de la testări ulterioare a pacienților cu mutații KRAS, în cazul în care este disponibil acest test [71]. Deși aceste mutații nu se exclud reciproc în totalitate, incidența tumorilor caracterizate prin mutații duble este <1% [72], ceea ce face ca această abordare să fie rațională și cost-eficientă. În prezent, există numai dovezi anecdotice privind beneficiile diferiților agenți la pacienții cu mutații RET, mutații HER2 și amplificări și cu alți biomarkeri. Probabil că această recomandare va evolua odată cu raportările din studii prospective care validează beneficiile pacienților din aceste subseturi. În plus, disponibilitatea din ce în ce mai largă a testărilor multiplex poate aduce în discuție acest aspect. Susținem că aceasta nu este o recomandare principală, deoarece nu sunt disponibile tratamente aprobate. Fiecare laborator va trebui să decidă dacă această abordare reprezintă o utilizare bună a resurselor inclusiv a rezervelor de material tisular, în special în contextul studiilor clinice de susținere. Recomandarea 6: Există un rol pentru testarea markerilor cu rol predictiv al răspunsului la chimioterapia citotoxică (ERCC1, RRM1, TS etc.)? Nu este recomandată testarea de rutină a acestor biomarkeri. Nu a fost validat niciun biomarker pentru anticiparea beneficiilor sau a rezistenței la agenții citotoxici disponibili în prezent [II, D] Numeroși factori au fost identificați ca markeri predictivi potențiali pentru chimioterapia specifică în NSCLC, printre care ERCC1, BRCA1, RRM1 și timidilat sintetaza (TS). Expresia scăzută a ERCC1 la IHC [73] și cea a ARNm [74 77] au fost asociate cu sensibilitatea la chimioterapia pe bază de cisplatină, însă rezultatele IHC nu au putut fi reproduse [78, 79] și evaluarea ARNm ERCC1 va trebui optimizată pe viitor în studii prospective înainte ca acest marker să poată fi luat în considerare pentru utilizarea de rutină. De asemenea, expresia scăzută a ARNm BRCA1 pare să confere sensibilitate față de agenții pe bază de platină, printre alte medicamente, însă conferă rezistență la taxanii care acționează țintit asupra tubulinei și la alcaloizii de vinca [76, 77, 80 83]. De asemenea, BRCA1 poate fi evaluată prin IHC [82 84], iar aceasta și testarea ARNm [76, 77, 80] par să fie reproductibile, ambele putând fi evaluate în studiile randomizate controlate ale NSCLC. Datele din studiile translaționale sugerează că IHC și expresia ARNm pentru RRM1 au rol prognostic și sunt asociate cu beneficii ale terapiei cu gemcitabină, însă un studiu prospectiv cu tratament individualizat nu a reușit să confirme acest lucru [79, 80]. Expresia scăzută a TS a fost asociată cu îmbunătățirea rezultatelor clinice la pacienții cu NSCLC nescuamos tratați cu pemetrexed. Într-un studiu prospectiv de fază II, expresia nucleară înaltă a TS s-a corelat cu un

7 Kerr et al prognostic mai nefavorabil, cu o supraviețuire globală mai scurtă, în urma tratamentului de linia a doua cu pemetrexed în monoterapie [85]. Deși sunt încurajatoare, sunt necesare pe viitor studii prospective de fază III pentru validarea reproductibilității IHC și a sistemului de clasificare utilizat. În prezent sunt în curs de evaluare alți markeri care ar putea anticipa beneficiile sau rezistența la chimioterapie. Există dovezi suficiente pentru a încuraja cercetările și a sugera succesul acestora, însă până acum niciun biomarker nu a fost evaluat în mod adecvat pentru utilizarea în practica clinică în scopul selectării pacienților candidați pentru administrarea unui anumit agent chimioterapeutic. Recomandarea 7: Care este rolul tehnologiilor aflate în curs de dezvoltare în testarea contemporană a biomarkerilor? Platformele multiplex, inclusiv așa-numitele tehnologii de generația următoare, pentru seturi de mutații specifice apar ca o abordare eficientă în raport cu costurile și cu resursele pentru analiza simultană a unor ținte potențiale multiple. Acestea reprezintă metode adecvate de testare pentru prezența mutațiilor, cu condiția implementării unor măsuri corespunzătoare de control extern al calității [III, A] Analiza genomică globală cu ajutorul tehnologiei de secvențiere de generația următoare este un instrument de cercetare valoros, însă nu a fost încă validată pentru utilizarea clinică [IV, C] Secvențierea de generația următoare (NGS, next-generation sequencing) este o tehnică puternică ce permite secvențierea unui număr mare de matrițe ADN într-o singură testare cu o sensibilitate înaltă și cu un cost relativ scăzut [86]. Un număr mare de date au fost generate cu ajutorul NGS pentru analize la nivelul întregului genom pe serii limitate de eșantioane de NSCLC, care au identificat modificări genetice asupra cărora se poate acționa țintit, iar acestea ar putea fi utilizate pentru dezvoltarea unor teste de diagnostic companion pentru medicamentele noi [87 91]. Platformele de testare multiplex (SNaPshot, spectrometria de masă MassARRAY MALDI-TOF etc.) pentru detectarea unor modificări specifice [92] sau resecvențializarea țintită prin NGS permit testarea în paralel a unor seturi de modificări genetice validate care constituie biomarkeri terapeutici. Datele publicate despre pacienții cu NSCLC din practica clinică obișnuită care implică eșantioane mici de biopsie/citologie rămân relativ limitate. O altă aplicație potențial importantă a NGS este secvențializarea ultraprofundă, o abordare cu sensibilitate extrem de înaltă pentru detectarea mutațiilor corelate cu cele de la nivelul tumorii primare în lichidele corpului, celulele tumorale circulante (CTC), plasmă sau ser [93 95]. Prelevarea de eșantioane în momente diferite cu ajutorul acestei metode poate ajuta la identificarea mutațiilor care apar după diferite linii de tratament. NGS oferă rezultate promițătoare pentru utilizarea pe viitor și, deși tehnologia nu este încă utilizată de rutină pentru orientatea tratamentului în NSCLC, acest aspect se va modifica în curând. Problemele asociate cu implementarea NGS includ absența reglării centrale și standardizarea platformelor utilizate, interpretarea și validarea rezultatelor, rambursarea costurilor, cerinţele privind ADN și implicațiile identificării mutațiilor rare. Recomandarea 8: Laboratoarele ar trebui să participe în programele de asigurare a calității? Da. Laboratoarele trebuie să fie acreditate pentru a efectua acest test și trebuie să participe în programe externe de asigurare a calității pentru păstrarea acreditării [V, A] Testele pentru biomarkeri care sunt necesare pentru stabilirea unor decizii clinice ar trebui să fie efectuate în laboratoare care respectă standardele specifice fiecărei țări pentru testarea diagnosticului clinic. Aceste standarde necesită în mod normal participarea la un program extern de asigurare a calității (EQA, external quality assurance) și succesul acestuia [96, 97]. Mai multe agenții diferite supervizează programele EQA de patologie moleculară din Europa (UKNEQAS, ESP, EMQN). De asemenea, laboratoarele trebuie să efectueze evaluări interne frecvente pentru asigurarea calității. Recomandarea 9: În ce mod ar trebui să fie raportate datele provenite din testarea anatomopatologică, moleculară și a altor biomarkeri? Raportările testărilor anatomopatologice, moleculare și ale altor biomarkeri ar trebui să includă rezultate și interpretări care sunt ușor de înțeles de oncologi și de anatomopatologi nespecializați [V, A] Atunci când este cazul, trebuie să fie descrise metodologia analitică, natura și calitatea eșantionului Este recomandată integrarea datelor anatomopatologice, moleculare și despre alți biomarkeri pentru un anumit caz, de obicei sub forma unui raport unic [V, A] Raportările trebuie să fie cât mai clare, concise și lipsite de ambiguitate. În Recomandarea 2 și în Tabelul 2 au fost menționate recomandări pentru raportarea subtipurilor de NSCLC pe eșantioane mici de diagnostic. Datele moleculare trebuie să fie raportate întotdeauna în asociere cu aspectul anatomopatologic al eșantionului testat și trebuie să fie interpretate în acest context [1 6], deoarece relevanța rezultatelor moleculare depinde de tipul tumoral și de calitatea eșantionului testat. Metodologia de testare determină sensibilitatea și specificitatea testului, iar aceste informații

doi:10.1093/annonc/mdu145 8 trebuie să fie disponibile, cu explicații adecvate, pentru a permite cititorului să evalueze semnificația rezultatelor testării. În cadrul raportului trebuie să fie prezente suficiente detalii pentru a descrie în mod adecvat rezultatele testului, pentru a permite interpretarea acestora și, prin urmare, pentru ghidarea terapiei. Trebuie să fie indicată relevanța acestor rezultate pentru potențialele alegeri terapeutice. Concluzii Patologia moleculară și testarea biomarkerilor reprezintă o direcție importantă de dezvoltare în stabilirea diagnosticului și stratificarea terapeutică a cancerului pulmonar. Complexitatea anomaliilor moleculare și evaluarea acestora, împreună cu provocarea de a furniza cât mai multe date solide pe eșantioane de diagnostic foarte mici, ridică multe întrebări pentru toate persoanele implicate în acest proces. Nu există un singur răspuns corect care să identifice persoana care ar trebui să solicite testarea; practica va depinde de organizarea locală și de sistemele sanitare, iar deciziile cu privire la modul în care se vor desfășura lucrurile necesită o discuție între persoanele implicate. Testarea reflexă, solicitată de anatomopatolog pentru stabilirea unui diagnostic adecvat, accelerează testarea, determinând un timp de răspuns mai rapid, dar poate determina efectuarea unor teste inutile. Testarea conform unei solicitări venite din partea oncologului ar trebui să garanteze că sunt efectuate numai testele necesare, însă această testare va avea loc mai târziu după stabilirea diagnosticului inițial. Până la stabilirea rolului clinic al biomarkerilor în carcinomul cu celule scuamoase, testarea de rutină a biomarkerilor în cazurile de cancer pulmonar în Europa este limitată în principal la adenocarcinoame sau la cazurile în care nu poate fi exclus acest diagnostic (tumori nescuamoase). Excluderea reciprocă, în toate scopurile practice, a mutațiilor relevante clinic din adenocarcinom susține abordarea prin testare secvențială care investighează prezența celei mai frecvente mutații (în Europa, mutația KRAS) și, dacă aceasta este absentă, prezența mutației de pe locul doi ca frecvență (mutația EGFR) și așa mai departe. Deși această abordare este economică în cadrul unui serviciu care utilizează testarea mutațiilor individuale, este și foarte cronofagă, potențial risipitoare din punctul de vedere al materialelor și nu este recomandată. Testarea paralelă a mutațiilor multiple din același eșantion tumoral (ADN) devine abordarea standard, în special în cazul utilizării platformelor de testare multiplex. Testarea ALK poate fi efectuată în paralel, probabil cu ajutorul unui prescreening prin IHC, sau poate urma unui screening negativ pentru mutații, deși beneficiile testării paralele, în privința timpului și a conservării tisulare, au fost deja luate în discuție. În Recomandarea 5, am luat în considerare utilizarea potențială a testării secvențiale pentru fuziunile rare ROS1 și RET în cazurile în care lipsesc alte mutații mai frecvente. În plus, dovezile din ce în mai numeroase cu privire la modificarea statusului molecular în urma tratamentului și la apariția rezistenței moleculare pot indica necesitatea repetării biopsiei în momentul progresiei tumorale, în cazul în care modificarea statusului biomarkerilor indică o nouă terapie țintită validată prin date adecvate. Acesta este un domeniu care evoluează. Aceste recomandări oferă un cadru pentru practicarea testărilor solide de patologie moleculară pe baza dovezilor publicate până în prezent și a opiniei experților. Acesta este un domeniu care se schimbă rapid, datorită dezvoltării tehnologiilor de testare moleculară și a terapiilor noi țintite în curs de apariție pentru care există biomarkeri cu rol predictiv. Probabil că aceste recomandări vor necesita actualizări viitoare pentru a reflecta modificarea practicii. Finanțare Toate costurile asociate cu conferința consensuală au fost acoperite de fondurile centrale ale European Society for Medical Oncology. Nu a existat o sursă externă de finanțare a evenimentului sau a producerii manuscrisului. Conflicte de interese Prof. Stahel a raportat consultanță/onorarii: Abbott, Amgen, Astellas, Boehringer Ingelheim, Daiichi-Sankyo, GlaxoSmithKline, Genentech, Eli Lilly, Roche. Dr. Felip a raportat consultanță/onorarii: Lilly, GlaxoSmithKline, Pfizer, Roche, Boehringer Ingelheim. Dr. Peters a raportat consultanță/onorarii: Roche, Eli Lilly, AstraZeneca, Pfizer, Boehringer Ingelheim, Bristol-Myers Squibb, Merck Serono, Daiichi Sankyo, Tesaro. Prof. Kerr a raportat comitet consultativ și/sau birou de speakeri: Abbott Diagnostics, Roche, AstraZeneca, Eli Lilly, Pfizer, Boehringer Ingelheim, Novartis, Merck Serono. Dr. Besse a raportat granturi pentru cercetare: Pfizer, Roche, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca. Prof. Vansteenkiste a raportat că este Președite Eli-Lilly în Oncologie Respiratorie la Universitatea Leuven (fonduri pentru cercetare) și Președinte AstraZeneca în Îngrijirea Personalizată a Cancerului Pulmonar la Universitatea Leuven (fonduri pentru cercetare). Dr. Eberhardt a raportat comitet consultativ: GSK, Amgen, Novartis, Merck, Teva, Roche, AstraZeneca, Lilly, Boehringer, Pfizer, BMS; birou de speakeri: Roche, AZ, Lilly, Boehringer, Pfizer, GSK, Amgen, Novartis, Hexal, Merck; granturi de cercetare: Eli Lilly. Dr. Edelman a raportat comitet consultativ și/sau fonduri pentru cercetare: Genentech, Boehringer Ingelheim, Lilly, Endocyte. Prof. Baas a raportat granturi pentru cercetare: Pfizer. Dr. Reck a raportat comitet consultativ: Hoffmann-La Roche, Lilly, Pfizer, AstraZeneca, Bristol-Myers Squibb, Daiichi- Sankyo; onorarii pentru conferințe: Hoffmann-La Roche, Lilly, Pfizer, Bristol-Myers Squibb, AstraZeneca, Daiichi- Sankyo. Dr. Paz-Ares a raportat consultanță științifică/ birou de speakeri: Lilly, Roche, Pfizer, Merck, Boehringer

9 Kerr et al Ingeheim, Desi pharma, Celgene. Dr. Meldgaard a raportat birou de speakeri: Roche. Dr. Nicolson a raportat birou de speakeri: Roche, Lilly, Boehringer Ingelheim, Pfizer, Otsuka; granturi de cercetare: Roche, Lilly, Boehringer Ingelheim, Pfizer, Novartis. Prof. Senan a raportat granturi de cercetare și onorarii: Varian Medical Systems; membru în grupul de management al studiului de faza III efectuat de Lilly Oncology. Dr. Faivre- Finn a raportat granturi de cercetare din partea AstraZeneca, Eli Lilly. Dr. Rocco a raportat birou de speakeri/granturi: Covidien. Mr. Lim a raportat sprijin pentru cercetare: ScreenCell și PointHope; anterior, birou de speakeri pentru Roche și Imedex și comitet consultativ pentru Strategen, Abbott Molecular și GSK; în curs de obținere a unui patent pentru Clearbridge BioMedics; deținere de acțiuni la Pfizer. Dr. Westeel a raportat consultanță/onorarii: Lilly, Roche, Boehringer Ingelheim și AstraZeneca (pentru conferințe); rol consultativ: Lilly, Roche și AstraZeneca; efectuează în prezent studii sponsorizate de Merck Serono. Prof. Mok a raportat: birou de speakeri și onorarii din partea: AstraZeneca, Roche, Eli Lilly, Merck Serono, Eisai, BMS, BeiGene, AVEO, Pfizer, Taiho, Boehringer Ingelheim, GSK Biologicals, Clovis Oncology; fonduri pentru cercetare din partea AstraZeneca. Prof. Bubendorf a raportat onorarii pentru conferințe: Pfizer, Roche și Abbott Molecular Inc.; cercetări sprijinite Roche și deținere de acțiuni ale acestei companii. Dr. Novello, Dr. Marchetti, Prof. Syrigos, Prof. Smit, Dr. Adjei, Prof. Van Schil, Prof. Douillard, Prof. Weder, Prof. De Ruysscher, Dr. Le Pechoux, Prof. De Leyn, Dr. Veronesi și Dr. Dooms au declarat că nu au potențiale conflicte de interese. Dr. Crinò și Prof. O Byrne nu au raportat potențiale conflicte de interese. Bibliografie 1. Kerr KM, Loo PS, Nicolson MC. Pathology and personalized medicine in lung cancer. Lung Cancer Manage 2013; 2: 35 46. 2. Kerr KM. Personalized medicine for lung cancer: new challenges for pathology. Histopathology 2012; 60: 531 546. 3. Thunnissen E, Kerr KM, Herth FJ et al. The challenge of NSCLC diagnosis and predictive analysis on small samples. Practical approach of a working group. Lung Cancer 2012; 76: 1 18. 4. Cardarella S, Johnson BE. The impact of genomic changes on treatment of lung cancer. Am J Respir Crit Care Med 2013; 188: 770 775. 5. Cagle PT, Allen TC, Dacic S et al. Revolution in lung cancer: new challenges for the surgical pathologist. Arch Pathol Lab Med 2011; 135: 110 116. 6. Pirker R, Herth FJF, Kerr KM et al. Consensus for EGFR mutation testing in non- small cell lung cancer: results from a European workshop. J Thorac Oncol 2010; 5: 1706 1713. 7. Lim E, Baldwin D, Beckles M et al. Guidelines on the radical management of patients with lung cancer. Thorax 2010; 65(suppl III): iii1 iii27. 8. Felip E, Gridelli C, Baas P et al. Metastatic non-small-cell lung cancer: consensus on pathology and molecular tests, first-line, second-line, and third-line therapy: 1st ESMO Consensus Conference in Lung Cancer; Lugano 2010. Ann Oncol 2011; 22: 1507 1519. 9. Neumeister VM, Anagnostou V, Siddiqui S et al. Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues. J Natl Cancer Inst 2012; 104: 1815 1824. 10. Portier BP, Wang Z, Downs-Kelly E et al. Delay to formalin fixation cold ischemia time : effect on ERBB2 detection by in-situ hybridization and immunohistochemistry. Mod Pathol 2013; 26: 1 9. 11. Engel KB, Moore HM. Effects of preanalytical variables on the detection of proteins by immunohistochemistry in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol Lab Med 2011; 135: 537 543. 12. Arber DA. Effect of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical reactivity of breast markers. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2002; 10: 183 186. 13. Babic A, Loftin IR, Stanislaw S et al. The impact of pre-analytical processing on staining quality for H&E, dual hapten, dual color in situ hybridization and fluorescent in situ hybridization assays. Methods 2010; 52: 287 300. 14. Chafin D, Theiss A, Roberts E et al. Rapid two-temperature formalin fixation. PloS One 2013; 8: e54138. 15. Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase Inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol 2013; 8: 823 859. 16. Savic S, Bode B, Diebold J et al. Detection of ALK-positive nonsmall-cell lung cancers on cytological specimens: high accuracy of immunocytochemistry with the 5A4 Clone. J Thorac Oncol 2013; 8: 1004 1011. 17. Dejmek A, Zendehrokh N, Tomaszewska M, Edsjö A. Preparation of DNA from cytological material: effects of fixation, staining, and mounting medium on DNA yield and quality. Cancer Cytopathol 2013; 121: 344 353. 18. Scagliotti GV, Parikh P, von Pawel J et al. Phase III study comparing cisplatin plus gemcitabine with cisplatin plus pemetrexed in chemotherapy-naïve patients with advanced-stage non-small cell lung cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 3543 3551. 19. Johnson DH, Fehrenbacher L, Novotny WF et al. Randomized phase II trial comparing bevacizumab plus carboplatin and paclitaxel with carboplatin and paclitaxel alone in previously untreated locally advanced or metastatic non-small cell lung cancer. J Clin Oncol 2004; 22: 2184 2191. 20. Travis WD, Brambilla E, Muller-Hermelink HK et al. (eds). World Health Organisation Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. Lyon: IARC Press 2004. 21. Thomas JS, Lamb D, Ashcroft T et al. How reliable is the diagnosis of lung cancer using small biopsy specimens? Report of a UKCCCR Lung Cancer Working Party. Thorax 1993; 48: 1135 1139. 22. Edwards SL, Roberts C, McKean ME et al. Preoperative histological classification of primary lung cancer: accuracy of diagnosis and use of the non-small cell category. J Clin Pathol 2000; 53: 537 540. 23. Schreiber G, McCrory DC. Performance characteristics of different modalities for diagnosis of suspected lung cancer: summary of published evidence. Chest 2003; 123; 115S 128S. 24. Rivera MP, Detterbeck F, Mehta AC, American College of Chest Physicians. Diagnosis of lung cancer: the guidelines. Chest 2003; 123: 129S 136S. 25. Burnett RA, Howatson SR, Lang S et al. Observer variability in histopathological reporting of non-small cell carcinoma on bronchial biopsy specimens. J Clin Pathol 1996; 49: 130 133. 26. Cataluña JJ, Perpiñá M, Greses JV et al. Cell type accuracy of bronchial biopsy specimens in primary lung cancer. Chest 1996; 109: 1199 1203. 27. Matsuda M, Horai T, Nakamura S et al. Bronchial brushing and bronchial biopsy: comparison of diagnostic accuracy and cell typing reliability in lung cancer. Thorax 1986; 41: 475 478. 28. Chuang MT, Marchevsky A, Teirstein AS et al. Diagnosis of lung cancer by fibreoptic bronchoscopy: problems in the histological classification of non-small cell carcinomas. Thorax 1984; 39: 175 178. 29. Travis WD, Brambilla E, Noguchi M et al. International association for the study of lung cancer/american thoracic society/european respiratory society international multidisciplinary classification of lung adenocarcinoma. J Thorac Oncol 2011; 6: 244 285.