CAPITOLUL 1

INTRODUCERE Infecţiile oportuniste de etiologie micotică fac parte din grupul bolilor infecţioase emergente şi au pondere din ce în ce mai mare în cadrul bolilor infecţioase, mai ales în contextul abuzului de antibiotice de sinteză (Odds şi colab., 1979). Gravitatea infecţiilor produse de Candida este determinată de echilibrul dintre patogenitatea microorganismului şi capacitatea de apărare a gazdei şi implică afectarea sistemul imun (Fromtling şi colab, 2003). Candida albicans este prezentă la aproximativ 50% din populaţie fără a provoca semne sau simptome de boală şi este localizată la diferite niveluri: cavitate bucală, vagin, tract gastrointestinal. Aceste zone pot constitui, sub acţiunea unor factori, adevărate "rezervoare" de Candida albicans, grăbind astfel apariţia manifestărilor (Colosi şi col., 2009). Aceşti factori pot fi: consumul prelungit de antibiotice, modificări apărute in timpul sarcinii, menstruaţiei, menopauzei sau în urma tratamentului cu medicamente hormonale, inclusiv cele anticoncepţionale, alţi factori de infecţie sau boli asociate, deficienţa sistemului imunitar, dar şi diabetul zaharat. Medicaţia antifungică alopată include diferite substanţe cum sunt hexoralul, fungizon, ampfocin, fluconazol, miconazol, etc. În ultimii ani, pe baza unor cercetări detaliate privind acţiunea competitivă a lactobacililor cu fungi din specia Candida albicans, au apărut formule naturale cu iaurt sau probiotice (Lactobaciluls acidophilus) care au dovedit a fi eficiente (Osset şi colab, 2001). Usturoiul este de asemenea recomandat, în acelaşi context. Prezenta teză de doctorat işi propune ca obiective studiul comparativ al unor plante aromatice care pot să aibă potenţial anti-candida. Astfel, ţinând seama de multitudinea compuşilor bioactivi din plantele aromatice şi medicinale, îndeosebi a uleiurilor volatile şi a compuşilor fenolici (mono-, di- sau polifenoli) care sunt cunoscuţi ca având potenţial antimicrobian, ne-am propus caracterizarea chimică a compoziţiei unor plante autohtone (16 tipuri de plante) şi relaţia acestor parametri cu acţiunea 1

antifungică, testată in vitro pe tulpini de Candida prelevate de la purtători, urmată de tratamente in vivo şi re-evaluări in vitro marcându-se efectele înregistrate. Acest studiu este menit să evidenţieze care dintre plantele studiate pot fi utilizate în diferite formule antimicotice. SCOP ŞI OBIECTIVE Scopul lucrării: caracterizarea chimică a unor extracte de plante bogate în compuşi fenolici cu potenţial antifungic şi testarea comparativă a acţiunii acestor extracte de plante aromatice şi medicinale cu potenţial anti-candida. Obiectivele cercetărilor noastre se referă la două aspecte: 1. Realizarea şi caracterizarea unor extracte din diferite plante medicinale şi aromatice din flora spontană sau cultivate în România care au potenţial antifungic, studiind compoziţia acestora în compuşi fenolici în relaţie cu acţiunea antioxidantă. 2. Testarea comparativă in vitro şi in vivo a acţiunii extractelor asupra unor tulpini diferite de Candida albicans (faringian, nazal, vaginal) prin evaluarea calitativă şi cantitativă a acţiunii acestora, pe pacienţi purtători (aparent sănătoşi, cu boli cronice sau după tratamente îndelungate cu antibiotice). Concluziile studiilor efectuate au ca finalitate selectarea celor mai eficiente extracte de plante care pot oferi acţiune antifungică pe termen lung, fără remisii. Structura tezei Teza include 4 capitole, primele două capitole sunt dedicate studiilor de literatură, iar două capitole prezintă rezultatele experimentale, conform celor două obiective menţionate mai sus. Capitolul 1, denumit Compuşi bioactivi cu potenţial antimicotic din plante medicinale şi aromatice, include date detaliate privind încadrarea botanică, istoric şi compoziţia chimică a fiecărei plante care a fost studiată Capitolul 2, denumit Genul Candida - caracterizare generală, tehnici de prelevare, cultivare şi examinare Capitolele de Cercetări proprii sunt următoarele: 2

Capitolul 3 - Caracterizarea unor extracte vegetale cu potenţial antimicotic include 3 studii experimentale paralele efectuate pe plante aromatice şi medicinale, după cum urmează: Studiul experimental 1: Realizarea unor extracte în alcool etilic şi oţet de mere, utilizând 8 plante medicinale şi aromatice Studiul experimental 2: Realizarea unor extracte hidroalcoolice şi hidroglicerice din 6 tipuri de plante medicinale şi aromatice Studiul experimental 3: realizarea şi studiul unor extracte hidrofilice de vâsc de diferite provenienţe (vâsc de măr sau de salcâm), distribuţia compuşilor fenolici în frunze şi stem, variaţia compoziţiei în funcţie de sezon şi determinarea capacităţii antioxidante utilizând metode specifice de evaluare a inhibiţiei radicalilor liberi (DPPH, TEAC) sau a proceselor antioxidante mediate ioni (FRAP, ORAC). Capitolul 4 - Testarea in vitro şi in vivo a acţiunii antimicotice a extractelor vegetale investigate pe diferiţi purtători de Candida albicans include Studii in vitro (4.1) şi Studii in vivo (4.2.). Subcapitolul 4.1. intitulat Studiile in vitro include rezultate privind evaluările cantitative de inhibare a proliferării in vitro a tulpinilor de Candida albicans prin spectrometrie UV-Vis (4.1.2.1.). Aceste studii au fost efectuate prin 6 module experimentale, în care s-au utilizat diferite extracte de plante, individuale sau asociate, la diferite concentraţii, urmărindu-se dinamica de inhibare la 24, 48 şi 72 de ore co-cultivare a extractelor cu tulpinile Candida albicans (faringiene sau vaginale sau nazale) prelevate de la 11 purtători diferiţi (aparent sănătoşi, dar cu diferite boli cronice sau după tratamente cu antibiotice). În paralel s-au făcut evaluări calitative (4.1.2.2.) pe mediu solid, prin acordare de scoruri. În secţiunea 4.1.2.3. s-au corelat datele obţinute prin determinările cantitative şi calitative. Subcapitolul 4.2. intitulat Studiile in vivo au fost derulate pe durata a 21 de zile de tratament al purtătorilor, urmate de investigaţii privind viabilitatea, respectiv rezistenţa fungilor Candida albicans faţă de tratament. 3

CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE CU POTENŢIAL ANTIMICOTIC Folosirea extractelor din plante este o formă alternativă tratamentului micozelor în general şi a candidozelor, în special, bucurându-se de o popularitate din ce în ce mai mare începând cu anii 1990 (Cowans, 1999). Datele de literatură au demonstrat că există relaţii direct proporţionale între tipul şi concentraţia compuşilor fenolici (de tip acid fenolic, procianidine, flavonoide sau taninuri) din plantele medicinale şi acţiunea antimicrobiană a acestor plante (Sher, 2009). Aceşti compuşi sunt sintetizaţi de plante în scop de apărare faţă de dăunători microscopici (mucegaiuri sau virusuri) sau macroscopici (insecte). Mecanismul de acţiune implică biosinteza unor elicitori (molecule de apărare imună şi toxine sintetizate, cu efect letal asupra dăunătorilor. În acest context, pentru a selecta plante şi tipuri de extracte cu efect antifungic, am investigat un număr de 16 plante, medicinale şi aromatice. Studiu experimental 1 Materiale şi metode S-au utilizat 8 specii de plante aromatice şi medicinale şi anume: Angelica archangelica (Angelica)(A); Silybum marianum (Armurariu) (B); Ocimum basilicum (Busuioc) (C); Ribes nigrum (Coacăze negre) (D); Coriandrum sativum (Coriandru) (E); Majorana hortensis (Maghiran) (F); Rosmarinus officinalis (Rozmarin) (G); Salvia officinalis (Salvie) (H); Plantele au provenit din culturi controlate (Staţiunea didactică experimentală a USAMV Cluj-Napoca) sau procurate de la PLAFAR Cluj-Napoca. Protocolul de extracţie şi evaluarea concentraţiei fiecărui extract prin spectrometrie UV-Vis Extracţia probei măcinată (5 g) a fost făcută mai întâi în etanol 35% (50 ml) apoi s-a folosit ca solvent de extracţie oţetul de mere de aciditate 5% (50 ml). Probele s-au sonicat la întuneric, 24 ore. Absorbanţa extractelor obţinute (nediluate sau diluate 1:10, 1:100, 1:1000 ), bogate in compuşi fitochimici, a fost înregistrată pe domeniul 200-700 4

nm (UV-Vis) cu ajutorul unui spectrofotometru JASCO/2005, pentru a stabili care este concentraţia totală de compuşi fenolici. Pentru acizi fenolici s-a urmărit semnalul caracteristic la 280 nm, pentru flavonoide la 340 nm, iar pentru antociani la 525 nm. Cuantificarea acizilor fenolici prin Cromatografie de Lichide de Înaltă Performanţă (HPLC) Extractele obţinute a fost supuse analizei, utilizând un cromatograf HPLC Shimadzu, echipat cu o pompă solvent binară, un degazor, cuptor pentru coloană şi un detector cu fotodiodă DAD (diode array detector). Coloana cromatografică, de tip SUPELCOSIL TM LC-18, 5µm, 25 cm x 4.6 mm, a fost utilizată la 30 0 C. Faza mobilă a constat din doi solvenţi: solventul A format din metanol : acid acetic: apă bidistilată în raport de 10:1:88 (v/v/v) şi solventul B format din metanol: acid acetic: apă bidistilată în raport de 90:3:7 (v/v/v). Determinarea concentraţiei de polifenoli totali prin metoda Folin-Ciocâlteu Conţinutul de polifenoli totali din toate probele (extracte alcoolice sau în oţet) s-a determinat prin metoda spectrofotometrică Folin-Ciocâlteu (Huang si colab., 2005). Determinarea activităţii antioxidante prin metoda DPPH Metoda DPPH (1,1,-difenil-2-picrilhidrazil) este o metodă spectrofotometrică, larg utilizată pentru a testa abilitatea compuşilor de a îndeparta radicalii liberi sau capacitatea lor de a dona hidrogen. Este utilizată pentru cuantificarea antioxidanţilor în sisteme bilogice complexe (Miliauskas şi colab., 2004). Protocolul de lucru folosit a fost conform metodei descrise de Brand-Williams şi colab., (1995). Rezultate şi discuţii Separarea şi cuantificarea prin HPLC a acizilor fenolici din plante medicinale Separarea unui amestec de standarde pure de acizi fenolici s-a realizat prin HPLC, în 30 minute. Ordinea eluţiei, în funcţie de timpii de retenţie, a fost: acid galic (4.3), acid protocatecuic (6,.7), acid clorogenic (13.15), acid cafeic (14.18), acid p-cumaric (19.9), acid ferulic (21.75), acid sinapic (22.65), acid o-cumaric (25.4). În figura I.1 se regăseşte 5

imaginea comparativă a amprentei cromatografice a extractului alcoolic comparativ cu cel acid (oţet) Ocimum basilicum. Ocimum basilicum (Oţet) Ocimum basilicum (alcool) mau Timp (min)/ Time (min Fig. I.1. Imaginea comparativă a amprentei cromatografice a extractului alcoolic comparativ cu cel acid (oţet) Ocimum basilicum (B) Fig. I.1. Comparing image of chromatographic fingerprint of alcoholic extract comparing to acidic (vinegar) for Ocimum basilicum (B) Analiza spectrometrică UV-Vis a extractelor în alcool şi în oţet S-au identificat maxime specifice pe domeniul 280-340 nm, specifice acizilor fenolici şi a flavonoidelor, care permit recunoaşterea unor compuşi fitochimici caracteristici (markeri spectrali). Determinareac activităţii antioxidante prin metoda DPPH Se constată că acţiunea antioxidantă maximă o are extactul de coacăze negre atât în alcool cât şi în oţet, deşi concentraţia de acizi fenolici este apropiată de a altor plante 6

ca: busuioc, măgheran, salvie. Acest fapt se explică prin potenţialul crescut antioxidant al antocianilor, superior faţă de acizii fenolici şi flavonoide îndeosebi în mediul acid. Dintre plantele medicinale salvia are cea mai mare acţiune antioxidantă în alcool şi de aproximativ 4 ori mai mică în oţet (tabel I.1.) Tabel I 1. Valorile concentraţiilor de fenoli totali şi activitatea antioxidantă (prin metoda DPPH) a extractelor din cele 8 plante medicinale, în alcoole etilic şi oţet de mere Tabel I.1 Concentrations value of total poliphenols and antioxidant activity (throught DPPH assay) of extracts obtained from 8 medicinal plants in alcohol and vinegar Nr. Planta Fenoli totali mg/ml extract alcoolic No. Plant Total phenolics mg/ml alcoholic extractt Activitatea antioxidantă mm Trolox/ml extract alcoolic Antioxidant activity mm Trolox/ml alcoholic extract Activitatea antioxidantă mm Trolox/ml extact în oţet Antioxidant activity mm Trolox/ml vinegar extract A Angelica archang. 0.64 6.07 0.38 B Silybummarianum 0.70 4.22 0.83 C Ocimum basili. 1.21 6.59 4.46 D Ribes nigrum 1.22 40.08 47.85 E Coriandrum sativ. 0.20 4.78 3.25 F Majorana hortensi 1.17 7.39 1.63 G Rosmarinus off. 1.09 6.92 3.30 H Salvia officinalis 1.16 37.50 8.04 Glucozidele flavonoidice şi compuşi procianidinici au t R mai mare de 30 minute şi apar în cantităţi semnificative în extractele studiate. Cantitatea de acizi fenolici este mai mică pentru extractele de angelica, armurariu şi rozmarin. Extractul alcoolic de măgheran este cel mai bogat în compuşi fenolici. În general s-au identificat atât în oţet cât şi în alcool regiuni specifice de recunoaştere a plantei marcate prin dreptunghiuri în 7

Fig.I.1. Alcoolul are o capacitate mai bună de a asigura o extracţie eficientă a flavonoidelor comparativ cu oţetul. Conţinutul în polifenoli totali determinat prin metoda Folin-Ciocâlteu În tabelul III.3. se regăsesc valorile obţinute în urma determinării cantitative a polifenolilor totali din extractele alcoolice, prin metoda spectofotometrică. S-a observat că cea mai mare cantitate de polifenoli totali se găseşte în extractul vegetal de coacăze negre (1.22 mg/ml) şi busuioc (1.21 mg/ml) în comparaţie cu extractul de coriandru care conţine doar 0.20 mg/ml. Conţinut asemănător în polifenoli totali (mg/ml extract) au măgheranul şi salvia. Concluzii Cea mai mare cantitate de polifenoli totali s-a găsit în extractul vegetal de Ribes nigrum şi Ocimum basilicum; Cea mai mare activitate antioxidantă corelată conţinutul de polifenoli a fost obţinută pentru extactul de Ribes nigrum atât în alcool cât şi în oţet; Dintre plantele medicinale cea mai mare acţiune antioxidantă în alcool s-a înregistrat pentru extractul de Salvia officinalis; În urma acestui experiment s-a constatat că alcoolul asigură o extracţie mai bună a flavonoidelor faţă de oţet; Oţetul asigură o extacţie mai bună a acizilor fenolici ; Studiu experimental 2 Materiale şi metode În cadrul acestui studiu s-au utilizat plante medicinale din speciile : Melissa officinalis (Roiniţă) din Timişoara (I), Melissa citronella (Cluj) (J); Echinaceea purpurea (Echinacea) (K) ; Cynara scolymus (Anghinarea) (L); Hypericum perforatum (Sunătoare) (M); Calendula oficinallis (Gălbenelele) (N). 8

Protocolul de extracţie şi evaluarea concentraţiei fiecărui extract prin spectrometrie UV-Vis În acest studiu, pentru obţinerea extractelor s-au utilizat 10g plantă medicinală uscată la 100 ml solvent de extracţie, fie amestec alcool etilic : apa în raport de 45:65 (%), fie amestec glicerina : apă în raport de 50:50 (%). Extracţia s-a efectuat pe durata a 7 zile, la întuneric şi la temperatura de 25 ºC. Analiza spectrometrică s-a făcut conform celei prezentate în sucapitolul III.1.2 din teză. Analiza HPLC Separarea HPLC a standardelor de acizi fenolici şi flavonoide s-a realizat confrom protocolul menţionat în subcapitolul. III.1.1.3 din teză. Rezultate si discuţii Analiza HPLC officinalis. În figura I.2. sunt prezentate cromatogramele HPLC extractelor de Calendula mau 4000 3500 3000 2500 2000 Calendula 1-acid galic 2-acid protocatecuic 4 - acid ca fe ic 5-acid p-cumaric 7-acid sinapic 8-acid o-cumaric 10-acid rozmarinic 7 10 1500 1000 500 0 n.i 1 2 4 5 n.i. 8 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Timp (min) Fig. I.2. Cromatogramele HPLC ale extractelor de Calendula oficinallis Fig. I.2. HPLC cromatograms of extracts Calendula oficinallis În Tabelul I.2. sunt prezentate cantităţile de acizi fenolici şi flavonoide mg/g probă uscată. Acid galic (27.77 mg/g) conţin doar gălbenelele. Acestea conţin cantitatea cea mai mare de acid cafeic (14.83 mg/g), acid sinapic (72.45 mg/g), acid o-cumaric (170 9

mg/g) şi acid rozmarinic (60.23 mg/g). Cel mai bogat extract vegetal în acid p-cumaric (8.44 mg/g), este cel de Echinaceea purpurea. Acid ferulic (15.38 mg/g) cantitatea cea mai mare se află în extractul de Melissa officinalis. Acid clorogenic (62.07 mg/g) şi acid protocatecuic (129.18 mg/g) în cantitatea cea mai mare se află în extractul de Hypericum perforatum. Flavonoidele se găsesc în cantitatea cea mai mare în extractul de sunătoare şi anume quercetina (176,22 mg/g) şi kaempherol (127,27 mg/g). Extractul de anghinare conţine în principal, miricetina (14,16 mg/g). Extractul de gălbenele conţine cea mai mare cantitate de acizi fenolici şi flavonoide. Extractele de Melissa officinalis şi citronella conţin acid rozmarinic şi acid cafeic în concentraţii diferite. Comparând conţinutul de acizi fenolici şi flavonoide (din extractele de plante medicinale studiate) s-a constatat că extractul de gălbenele este cel mai bogat în acizi fenolici (250 mg/g), iar extractul de sunătoare este cel mai bogat în flavonoide (quercetina şi kaempherol cu un total de 300 mg/g). Studiu experimental 3 Materiale şi metode Vâscul (Viscum album) a fost prelevat în diferite luni (decembrie, mai, iunie, iulie) pe parcursul anului 2009 din diferite locatităţi din Nord-Vestul Transilvaniei. Probele au fost denumite în conformitate cu arborele gazdă pe care îl semi-parazitează, astfel: VAM vâscul care parazitează mărul (Mallus domestica) şi VAS vâscul care parazitează salcâmul (Robinia pseudoacacia). S-au utilizat frunze (VAM L şi VAS L) şi stem (VAM S şi VAS S) de la aceste probe. Protocolul de extracţie şi analiza spectrometrică Frunzele, respectiv stemul probelor de vâsc au fost cântărite şi rapid uscate (pentru a preveni acţiunea enzimelor) într-o etuvă la 90 0 C, timp de 48 de ore. S-a determinat apoi substanţa uscată a probelor. Pentru extracţia compuşilor bioactivi s-a folosit metoda descrisă de Sakakibara şi col., 2003, cu unele modificări. Activitatea antioxidantă a compuşilor fitochimici se poate determina prin diferite metode. Compusii hidrofilici (compusii fenolici) au mecanisme ionice prin care actioneaza ca reducatori (donori de electroni), metodele optime de determinare a acţiunii antioxidante fiind FRAP şi TEAC. 10

Tabel I.2. Concentraţiile de compuşi fenolici individuali şi totali obţinute prin analiza HPLC din plantele medicinale investigate Table I.2. Concentrations of each phenolic compounds and total phenolics determined through HPLC analysis from medicinal plants investigated Denumire probă Sample name Melissa officinalis Melissa citronella Echinaceea purpurea Cynara scolymus Hypericum perforatum Calendula oficinallis Acid galic Acid protoca tecuic Acid cloroge nic Acid cafeic Concentraţia compus fenolic mg/g probă Phenolic compound concentration mg /g sample Acid Acid Acid Rutina p- ferulic sinapic cumaric Acid o- cumari c Miricet ina Querceti na Kaemp herol Acid rosmarini c Totali polifenoli mg/g probă Total polyphenols mg/g sample 0 54.05 0 4,09 0 15.38 0 0 0 0 0 0 23.92 97.44 0 0 0 3,63 0 0 0 7.15 0 0 0 0 14.18 24.96 0 31,09 0 0 8.44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 31.70 0 0 13.71 0 0 0 14.51 12.04 0 0 0 129.18 62.07 0 0 0 0 8.07 0 0 176.22 127.27 0 502.81 27.77 26.5 0 14.83 5.72 0 52.45 40 0 0 0 0 80 219.50 39.53 71.96 11

Cuantificarea acizilor fenolici prin Cromatografie de Lichide de Înaltă Performanţă Probele au fost extrase conform protocolului de la subcapitolul III.1.1.1. Extractul a fost supus analizei HPLC conform protocolului descris în subcapitolul III.1.1.2. Cromatogramele obţinute au fost monitorizate la 280 nm. Pentru cuantificarea rezultatelor s-au determinat curbele de etalonare a 9 standarde (acid galic, acid protocatecuic, acid cafeic, acid siringic, acid ferulic, acid sinapic, naringina, quercetina, kaempherol). Evaluarea activităţii antioxidante Metoda DPPH, s-a realizat conform protocolului descris în subcapitolul III.1.1.4. Metoda ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) este o metodă folosită pentru măsurarea capacitaţii antioxidante a diferitelor probe. S-a urmarit principiul metodei stabilit de Huang si colab., 2002, ce constă în măsurarea degradarii unei molecule fluorescente în prezenţa unui generator de radicali liberi de tip peroxil (Huang şi colab., 2002, Cao şi colab., 1998). Metoda FRAP (ferric reducing antioxidant power) este o metoda simplă spectrofotometrică care testează puterea antioxidantă a probelor luate în studiu, şi se bazează pe reducerea complexului tripiridiltriazina ferică (Fe(III)-TPTZ) la complexul tripiridiltriazina feroasă (Fe(III)-TPTZ) de către un reductant la ph acid (Benzie, 1996). Metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity) se bazează pe abilitatea antioxidanţilor de a diminua viaţa radicalului cation (ABTS + ), un cromofor albastru verde care absoarbe la 734 nm, comparativ cu Trolox (Arnao şi colab., 2001). Rezultate şi discuţii Cuantificarea acizilor fenolici din vâsc prin metoda HPLC Fig.I.3.conţine cromatogramele extractelor VAM ( L si S), şi VAS ( L si S). Tabelul I.3. include valorile obţinute pentru determinarea compuşilor fenolici din 12

vâsc de pe măr şi salcâm, calculate pe baza curbei de calibrare HPLC cu standarde, prezentată mai sus. 70000 mau 60000 50000 40000 30000 2 VAML_H_AcEt 1-Galic - 2-Protocatecuic7,597 3-Cafeic 13,154 4-Siringic 13,353 5-Ferulic 20,273 6-Sinapic 20,583 7-Naringina 27,585 8-Quercetina 30,014 9-Kaempherol - 8 20000 10000 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Timp (min) mau 70000 60000 50000 40000 30000 VAMs_H_AcEt 1-Galic 4,570 2-Protocatecuic7,627 3-Cafeic 13,089 4-Siringic 13,827 5-Ferulic 20,668 6-Sinapic 21,091 7-Naringina 27,530 8-Quercetina - 9-Kaempherol - 20000 1 2 3 4 5 6 7 10000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Timp (min) Fig. I.3. Cromatograma HPLC a extractelor din frunze şi stem de vâsc VAM care parazitează mărul A). VAM L B). VAM S Fig. I.3. HPLC chromatogram of leaves and stem extracts of mistletoe that parasites apple tree (VAM) A). VAM L B). VAM S 13

Tabelul I.3. Compuşi polifenolici totali (acizi fenolici şi flavonoide) în diferite extracte de vâsc de pe măr şi salcâm Table I.3. Total polyphenolic compounds (phenolic acids and flavonoids) from different mistletoe extracts that parasites apple and acacia trees Proba Compuşi polifenolici (acizi fenolici şi flavonoide)* - (µg/g probă uscată) Sample Phenolic compunds (phenolic acids and flavonoids)* - (µg/g dry sample) VAM S 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. VAM L nd. 4.10 6.39 nd. 7.81 2.11 nd. 0.36 nd. VAS L 39.93 0.37 nd. nd. 9.93 19.32 nd. 7.90 7.58 VAM S nd. nd. 6.81 nd. 6.88 1.13 nd. nd. nd. VAS S nd. 2.01 nd. nd. nd. nd. nd. nd. 6.38 * - numerotarea şi denumirea compşiilor polifenolici este redată în Tabelul III.9. nd.** - nedetectabil Se constată că VAM L şi S sunt mai bogate în acid ferulic, având concentraţii de 7.81 şi respectiv 6. 88 µg/g iar VAS L este bogat în acid galic, în timp ce VAS S în kaemferol, cu concentraţii de 39.93 şi respectiv 6.38 µg/g. În extractele de vâsc nu s-au pus în evidenţă prezenţa acidului siringic (4) şi a acidului galic (1), cu excepţia probei VAS L în care s-a detectat o cantitate remarcabilă comparativ cu ceilalţi acizi fenolici, de 39.93 µg/g probă uscată. De asemenea, frunzele de vâsc sunt mai bogate decât stemul, probei VAM. În figurile I.3 şi I. 4 sunt prezentate cromatogramele HPLC a extractelor de vâsc recoltate de pe măr şi salcâm. Extractul de frunze de vâsc care creşte pe salcâm este cel mai bogat în compuşi bioactivi. Evaluarea activităţii antioxidante prin metodele DPPH, ORAC, TEAC, FRAP În ultimii ani au fost studiate intens efectele antioxidante a extractului de vâsc aparţinand speciei Viscum coloratum, activitate datorată în special flavonoidelor (Leu şi colab., 2006, Yao şi colab., 2006, Shi şi col., 2006; Vicaş şi colab., 2008; 2009). Majoritatea extractelor de plante prezintă proprietaţi antioxidante, în special datorită compuşilor bioactivi aparţinând clasei polifenolilor (Aqil şi colab., 2006). 14

Determinarea activităţii antioxidante prin metoda DPPH În Tabelul I.4. sunt prezentate gradul de inhibiţie a radicalului DPPH exercitat de extractele apoase de vâsc VAM şi VAS (frunze şi stem). Tabel I.4. Capacitatea de inhibare a radicalului DPPH de către compuşii cu potenţial antioxidant din extractul de vâsc Tabel I.4. Inhibition capacity of DPPH radical by coumpounds from mistletoe extract with antioxidant potential Probe Inbibare a DPPH (%) Decembrie Mai Iulie Samples Inhibition of DPPH (%) December May July VAM L 5,2±0,00 12,09±0,01 2,22±0,01 VAS L 6,05±0,01 23,23±0,01 11,49±0,04 VAM S - 7,4±0,00 - VAS S 9,45±0,01 21,37±0,01 2,56±0,02 Valorile înregistrate prin metoda DPPH, arată că activitatea antioxidantă este semnificativ mai mare în luna mai, explicabil prin stimularea activităţii enzimatice specifice sezonului de primăvară. Determinarea activităţii antioxidante prin metoda ORAC Valorile obţinute prin metoda ORAC arată că acestea sunt influenţate de perioada de recoltare a produsului vegetal. Valorile ORAC sunt mai mari pentru probele recoltate în decembrie. Determinarea activităţii antioxidante prin metoda TEAC Valorile TEAC obţinute în urma investigării diferitelor extracte de vâsc, au arătat că activitatea antioxidantă cea mai mare s-a înregistrat în luna mai îndeosebi în stem. Determinarea activităţii antioxidante prin metoda FRAP Din punct de vedere al valorilor FRAP am obtinut diferenţe între extractele recoltate în diferite perioade de timp. Dintre extractele investigate, cea mai mare activitate antioxidantă a prezentat-o extractul VAS S (4,23±0,87 mg/l echivalent vitamina C/g stem) recoltat în luna mai. 15

Concluzii Concentraţia totală de compuşi fenolici în vâscul de salcâm (VAS L) ajunge la valori de aprox. 84 mg/kg plantă uscată, în timp ce la măr (VAM L) de 4 ori mai puţin. In acelaşi timp, în stem, la VAM concentraţia de compuşi fenolici este de aprox 14 mg/kg, mai mare de 2 ori decât la VAS S. Comparativ cu plantele medicinale de mai sus, concentraţia în compuşi fenolici este semnificativ mai mică. Activitatea antioxidantă hidrofilă la vâsc a fost evaluată prin metodele FRAP şi TEAC, respectiv DPPH şi ORAC. Activitatea antioxidantă este mai mare la probele recoltate în luna mai, când procesele biosintetice sunt mai intense. Metodele TEAC si FRAP dau valori mici şi similare la cele două tipuri de extracte. În concluzie, considerăm că cele două metode DPPH şi ORAC dau informaţii complementare şi evidenţiază specific potenţialul diferit al extractelor VAM şi VAS. Corelând compoziţia în compuşi fenolici cu acţiunea antioxidantă s-a constatat că vâscul recoltat de pe salcâm VAS are valori maxime de compuşi fenolici şi concomitent, o activitate antioxidantă intensă. TESTAREA IN VITRO ŞI IN VIVO A ACŢIUNII ANTIMICOTICE A EXTRACTELOR VEGETALE INVESTIGATE PE DIFERIŢI PURTĂTORI DE CANDIDA ALBICANS Plantele medicinale sunt utilizate ca tratamente alternative în diferite stări de boală. Tot mai multe recomandări susţin tratamentele alternative bazate pe extracte de plante deoarece oferă şi protecţie organismului în lupta cu patogenii şi stimulează sistemul imun (Bilia şi colab., 2002; Cichewicz şi colab.,1996; D auria şi colab., 2005.). Candida albicans este un patogen ce poate cauza infecţii locale sau sistemice, putând afecta pacienţii ce au o imunitate scăzută şi pe cei supuşi unor tratamente îndelungate cu antibiotice (Istrati-Ghinţescu.,1979; Zhang şi colab., 2003; Polak şi colab., 1985). Potenţialul patogen se manifestă numai în anumite 16

condiţii, dar există şi factori favorizanţi care duc la manifestarea acestuia (Cutler, 1991). În urma tratamentului cu extracte vegetale la om şi animale, până acum, nu s-au obţinut rezultate spectaculoase împotriva acestui patogen, deşi se cunosc câteva specii de plante care au efect anti-candidozic. Aceste date preliminare şi unele contradictorii justifică derularea unor cercetări care să identifice extracte de plante cu acţiune anti-candida (Petran şi colab., 2006; Lemar şi colab., 2002; Shams şi colab., 2006; Mir-Rashed şi colab., 2010). Obiectivele prezentului capitol sunt: Evaluarea (calitativă şi cantitativă) a acţiunii diferitelor extracte de plante aromatice şi medicinale (caracterizate conform datelor din capitolul III.) in vitro, pe diferite tulpini de Candida albicans (faringian, vaginal sau nazal) recoltate de la purtători aparent sanătoşi. Au fost elaborate 6 module experimentale, fiecare cu protocol specific. Utilizarea pentru tratamente locale (21 de zile) in vivo a extractelor care au dovedit acţiune inhibitoare in vitro. În funcţie de prezenţa sau absenţa patogenului, după 21 de zile s-a trecut sau nu, la însămânţarea pe mediul lichid. La probele care au fost pozitive s-au însămânţat tulpinile pe mediul solid şi lichid şi după 24, 48, 72 h s-a identificat microscopic prezenţa patogenului şi s-a determinat cantitativ rata sa de proliferare în prezenţa aceluiaşi tip de extract vegetal, care s-a dovedit eficient în modulele experimentale in vitro. Re-evaluarea sensibilităţii in vitro a tulpinilor de Candida (recoltate de la purtătorii trataţi in vivo) faţă de aceleaşi tipuri de extracte. Studii in vitro IV.1.1. Materiale şi metode Efectul in vitro al acţiunii antifungice al extractelor de plante medicinale a impus utilizarea de tulpini patogene de Candida prelevate de la diferiţi purtători P 1 P 11. S-au prelevat tulpini de Candida albicans fie de la purtători aparent sănătoşi, fie de la purtători cu diferite afecţiuni. Tulpinile recoltate au fost inoculate pe medii de cultură standardizate. 17

Material vegetal: Extractele vegetale utilizate au fost de Ocimum basilicum (busuioc), Coriandrum sativum (coriandru), Rosmarinus officinalis (rozmarin), Salvia officinalis (salvie), Angelica archangelica (angelica), Silybum marianum (armurariu), Ribes nigrum (coacăze negre), Majorana hortensi (măghiran), Echinaceea purpurea (echinacea), Hypericum perforatum (sunătoare), Calendula officinalis (gălbenele), Melissa officinalis (Roiniţă) din Timişoara, Melissa citronella, Cynara scolymus (anghinare), Vîscum album (vâsc). Descrierea etapelor experimentale Pentru a obţine tulpina de patogen dorită, s-a procedat astfel: s-au izolat în condiţii de laborator fungi din prelevatele patologice (secreţie faringiană, secreţie nazală, secreţie vaginală) prin însămânţare prin etalare în puncte fixe şi mai târziu prin alte tehnici, pe mediu solid şi lichid. După o incubare de 24, 48, 72 h, placa Petri s-a examinat macroscopic şi microscopic. Culturile de Candida albicans de la purtători au fost incubate la 37 ºC, urmând a fi folosite fragmente pentru testările ulterioare. Fiecăreia i s-a atribuit un număr de identificare şi s-au notat caracterele culturale. Determinări cantitative (pe mediul lichid) Evaluarea cantitativă a activităţii antimicotice,,in vitro s-a realizat în urma punerii în contact a tulpinii agentului fungic în cauză cu antimicoticul pe care l-am considerat control pozitiv (hexoral) şi cu extractele vegetale menţionate mai sus. în concentraţii de la 0,2% până la 8%. După obţinerea culturii pure de C. albicans s-au luat fragmente din colonie şi s-au transplantat în mediu Sabouraud lichid. O importanţă deosebită am acordat-o anamnezei purtătorilor (P1- P11), care pe lângă simptomele subiective caracteristice candidozei a relevat prezenţa unei simptomatologii de bază, date de o boală de ordin general sau loco-regional, cu ecouri asupra economiei întregului organism, predispozante la micoză. Evaluarea acţiunii antifungice s-a făcut în şase module experimentale, prezentate în tabelul I.5. 18

Tabel I.5. Module experimentale şi extracte utilizate pentru testarea acţiunii anti-candida in vitro. Tulpini recoltate de la diferiţi pacienţi ( P1-P11) Table I.5. Experimental modules and extracts used for testing the action of anti-candida in Modul experimental Experimental module Abreviere purtator Abreviation bearer 1. P 1 P 2 P 3 2. P 4 P 5 P 6 vitro. Strains collected from different patients (P1-P11) Sursa de recoltare Prelevation source Faringian Faringian Extracte utilizate Extract studied Busuioc, Coriandru,Rozmarin, Salvie Angelica, Armurariu, Coacăze negre, Măgheran Echinaceea, Sunătoare, Gălbenele Amestec extracte A 1 busuioc+coriandru (1:1) A 2 rozmarin+salvie (1:1) 3. P 7 Vaginal Melissa Anghinare HA si HG 4. P 8 Nazal VAM S si VAS L VAS S şi VAS L Faringian VAM S 5. P 9 P 10 Melissa Echinaceea Calendula 6. P 11 Vaginal Amestec extracte A 3 busuioc+coriandru (1:3) A 4 salvie+rozmarin (1:3) Module experimentale Patogenul Candida albicans prelevat de la purtători a fost co-cultivat cu diferite concentraţii de extract vegetal (0,2 %; 0.5 %; 1 %; 2 % ; 3 %; 4 %; 5 %; 6 %; 7 %, 8 %) în mediul de cultură lichid. Pentru fiecare probă experimentală (abreviată PE), mediul de cultură lichid a fost inoculat cu aceeaşi tulpină de Candida albicans (10 6 celule ml ) prelevată de la purtătorii P 1 -P 11 ). Toate analizele s-au realizat in triplicat. La fiecare 24 ore s-a măsurat absorbţia specifică a fiecărei probe la λ= 560 nm, utilizând un spectrofotometru de tip ABLE-JASCO 530. Rata de proliferare celulară a fost determinată prin măsurarea densităţii optice la 24, 48, 72 h de la cocultivare cu extractele vegetale şi/sau Hexoral. 19

IV.1.1.4 Evaluare calitativă (pe mediu solid) Metoda calitativă determină gradul de inhibiţie pe mediul solid şi constă în măsurarea diametrului ariei de inhibiţie a agentului fungic, ca urmare a acţiunii produsului antimicotic. Rezultatul s-a citit la un interval de 24, 48, 72 ore. Pentru studiile pe mediul solid Sabouraud s-au folosit plăcile notate control - în care patogenul s-a dezvoltat în condiţii normale şi plăci în care au fost făcute co-culturi cu concentraţii de extracte vegetale de 0.2 %; 0.5 %; 1 %; 2 %; 3 %; 4 %; 5 %; 6 %; 7 %; respectiv 8 %. S-a urmărit evoluţia/involuţia culturii agentului patogen la 24, 48, şi 72 ore prin comparare cu placa martor. Culturile s-au examinat zilnic, urmărindu-se aspectul macroscopic (suprafaţa, relieful, culoarea, prezenţa pigmentării, consistenţa şi viteza creşterii). În timpul dezvoltării coloniile îşi schimbă aspectele macroscopice. Aspectele coloniilor s-au notat periodic pentru a surprinde toate caracterele culturale. Paralel s-a făcut şi examenul morfologic al fragmentelor de colonii. Temperatura de incubare după însămânţare a fost de 36º-37ºC. În funcţie de gradul de inhibiţie a dezvoltării coloniilor patogene s-a stabilit caracterul acţiunii extractelor vegetale: antifungic pronunţat; antifungic moderat, antifungic slab. După însămânţari repetate, trei la număr, pe mediu Sabouraud s-a determinat caracterul extractului. Rezultate şi discuţii Evaluarea cantitativă a acţiunii antifungice Modul experimental 1 Figura I.4. reprezintă gradul de inhibiţie al diferitelor extracte vegetale comparativ cu controlul negativ, exprimat în procente, după 24, 48 şi 72 ore de cocultivare cu specia C. albicans. La purtătorul P 1 se constată o variaţie a efectului dependent de doză şi de tipul de extract. În general extractul de Coriandrum sativum (coriandru) a avut cel mai intens efect antifungic (apropiat de controlul pozitiv/hexoral), urmat de Ocimum basilicum (busuioc), în timp ce Rosmarinus officinalis (rozmarin), Salvia officinali (salvie) au avut efect inhibitor redus. Ordinea descrescătoare efectului antifungic la acest purtător a fost: Hexoral> coriandru>busuioc> salvia>rozmarin 20

Perioada 24-48 ore pare să fie optimă pentru a identifica activitatea antifungică. După 48 ore aceasta se menţine aproape constantă. 40 20 Grad de inhibiţie (%) Inhibition degree(%) 0-20 -40-60 -80 Ocimum basilicum Coriandrum sativum Rosmarinus officinalis Salvia officinalis Control + -100 24h 48h 72h 24h 48h 72h 0,2% 8% PURTĂTOR P1/ BEARER P1 Fig. I.4. Gradul de inhibiţie (%) al diferitelor extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans recoltat de la purtătorul P 1 Fig. I.4. The degree of inhibition (%) of different vegetal extracts co-cultured with C. albicans collected from P1 bearer La purtătorul P2, extractul de Ribes nigrum (coacăze negre), îndeosebi la concentraţia de 8%, are acţiune inhibitoare, maximă la 48 de ore, urmată de extractul de Angelica archangelica (angelica). Extractul de Silybum marianum (armurariu) are un efect de inhibare a creşterii patogenului Candida numai în primele ore, dar devine stimulator la 72 de ore. Ordinea descrescătoare efectului antifungic la acest purtător a fost: Hexoral> coacaze>maghiran > angelica>armurariu La purtătorul P 3 toate cele 3 extracte (echinaceea, sunătoare, calendula) au efect inhibitor la toate concentraţiile, dupa 48 de ore, şi maxim după 72 de ore. Asemenea celorlalte variante, valorile inhibiţiei de la 48 de ore nu cresc semnificativ la 72 de ore. Ordinea descrescătoare efectului antifungic la acest purtător a fost: Hexoral = echinaceea= sunatoare >calendula Dupa 72 ore, la o concentraţie de 8%, efectul a fost similar pentru toate extractele şi similar cu cel al hexoralului. 21

Concluzii Datele obţinute în modulul experimental 1 au demonstrat acţiunea inhibitoare semnificativă a extractelor de plante, îndeosebi pentru coriandru, coacăze, echinaceea, sunătoare şi calendula. Acţiunea a fost dependentă de concentraţie şi de durata cocultivării. Modul experimental 2 Figura I.5. reprezintă gradul de inhibiţie al diferitelor extracte vegetale comparativ cu controlul negativ, exprimat în procente, după 24, 48 şi 72 ore de co-cultivare cu C. albicans prelevat de la purtătorul P4. 20 0 Grad de inhibiţie (%) Inhibition degree (%) -20-40 -60 A1 A2 Control + -80-100 24 h 48h 72h 24 h 48h 72h 0,2% 8% PURTĂTOR P4/ BEARER P4 Fig I.5. Gradul de inhibiţie (%) al diferitelor extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans recoltat de la purtătorul P 4 Fig I.5. The degree of inhibition (%) of different vegetal extracts co-cultured with C. albicans collected from P4 bearer Amestecul A 1 (busuioc+coriandru, 1:1) a fost, în mod semnificativ mai activ decât A 2 (rozmarin + salvie, 1:1), atât la 0,2% cât şi la 8%, dar nu s-au remarcat diferenţe semnificative între % de inhibiţie la aceste concentraţii, atât la 48 de ore cât şi la 72 de ore. Am remarcat efect sinergic între acţiunea inhibitoare a extractului de coriandru şi busuioc (observat la P 1 ) în timp ce asocierea rozmarinului cu salvia (care nu au avut efecte semnificative independent) nu au îmbunătăţit efectul antifungic prin asociere. La purtătorul P 4 amestecul de extracte A 1 (busuioc+coriandru, 1:1 ) a fost, în mod semnificativ mai activ decât A 2 (rozmarin + salvie, 1:1), atât la 0,2% cât şi la 8%, dar nu s-au remarcat diferenţe semnificative între % de inhibiţie la aceste concentraţii, atât la 48 de ore cât şi la 72 de ore. S-a remarcat un efect sinergic între acţiunea inhibitoare a 22

extractului de coriandru şi busuioc (observat la P 1 ) în timp ce asocierea rozmarinului cu salvia (care nu au avut efecte semnifcative independent) nu au îmbunătăţit efectul antifungic prin asociere. La purtătorul P 5 acelaşi amestec de extracte a determinat rezultate similare demonstrând că efectul antifungic al amestecului A 1 este reproductibil. Efectul antifungic al extractului A 2 ( rozmarin + salvie, 1:1) a fost şi în acest caz mai redus, reprezentând aprox. 60% din efectul extractului A 1. La purtătorul P 6 aceleaşi amestecuri de extracte A 1 şi A 2 au determinat rezultate similare cu purtătorul P 5, demonstrând că efectul lor antifungic este reproductibil. Efectul antifungic al extractului A 2 ( rozmarin + salvie, 1:1) a fost şi în acest caz mai redus, repezentând aprox. 60% din efectul extractului A 1. Concluzii Tulpinile de Candida faringiene de la cei trei purtători P 4 -P 6 au răspuns similar faţă de extractele adminstrate. Extractul cu activitate fungică evidentă este amestecul busuioc+coriandru, 1:1, îndeosebi la o concentraţie de 8%. Modul experimental 3 Figura I.6. reprezintă gradul de inhibiţie (%) indus de extracte hidroalcoolice de Melissa officinalis (Roiniţă) din Timişoara, Melissa citronella, Cynara scolymus (anghinare) comparativ cu controlul negativ, exprimat în procente, asupra patogenului C. albicans după 24, 48 şi 72 ore.. 40 20 Grad de inhibiţie (%) Inhibition debree (%) 0-20 -40-60 -80 Melissa officinalis Melissa Timişoara Melissa citronella Cynara scolymus Control + -100 24 h 48h 72h 24 h 48h 72h 0,2% 8% PURTĂTOR P7/ BEARER P7 (HA) Fig I.6.Gradul de inhibiţie al diferitelor extracte vegetale hidroalcoolice (HA) co-cultivate cu C. albicans vaginal recoltat de la purtătorul P 7 Fig I.6. The degree of inhibition (%) of different hidroalcoholic vegetal extracts cocultured with C. albicans collected from P7 bearer 23

Toate extractele hidroalcoolice (HA) au avut acţiune mai slabă decât hexoralul, dar Cynara scolymus (anghinare) a dovedit a avea efect inhibitor la concentraţie de 8%, indiferent de durata incubării (constant la 24, 48 si 72 ore). În general, extractele de Melissa officinalis (Roiniţă) din Timişoara, Melissa citronella au indus efecte similare, apropiate de anghinare după 72 ore de co-cultivare la 8% superioare. Concluzii În prezenţa extractelor vegetale hidroalcoolice şi hidroglicerice patogenicitatea şi virulenţa celulelor de Candida albicans este redusă, efectul inhibitor al extracului de anghinare, la 8%, după 72 de ore fiind superior Hexoralului. Extractele hidroglicerice (HG) au avut efect inhibitor mai intens decât cele hidroalcoolice, dar nu semnificativ statistic În general acţiunea inhibitoare este maximă la 72 ore de co-cultivare dar este eficient şi la 24 ore. Extractele de Melissa au avut acţiune inhibitoare similară, constantă pe interval 48-72 de ore. Modul experimental 4 Gradul de inhibiţie (%) indus de extracte de Viscum album (vâsc) este reprezentat în figura I.7. comparativ cu controlul negativ, asupra patogenului C. 40 20 Grad de inhibiţie (%) Inhibition degree (%) 0-20 -40-60 -80 VAM S VAM L VAS S VAS L CONTROL+ -100 24 h 48h 72h 24 h 48h 72h albicans după 24, 48 şi 72 ore. 0,2% 8% PURTĂTOR P8/BEARR 8 Fig. I.7.Gradul de inhibiţie al diferitelor extracte de vâsc co-cultivate cu C. albicans nazal recoltat de la purtătorul P 8 Fig I.7. The degree of inhibition (%) of different mistletoe extracts co-cultured with C. albicans collected from bearer P 8 24

Concluzii Extractul de vâsc ce parazitează mărul (VAM) a demonstrat efect similar inhibitor cu controlul pozitiv, chiar mai intens în cazul extractului de stem (S) decăt cel de frunze (L), mai intens la măr decât la VAS (S sau L). Extractul de VAM S a inhibat creşterea culturii de C. albicans chiar de la 24 de ore, fiind mai eficient decât Hexoralul la concentraţia de 8%. Efectul inhibitor a fost semnificativ mai mare la concentratia de 8% şi nu a crescut semnificativ de la 48 la 72 de ore. În general acţiunea inhibitoare a vâscului a fost mai redusă decât la plantele medicinale investigate în modulele experimentale 1-3. Modul experimental 5 Pornind de la rezultatele obţinute în modulele anterioare, au fost selectate extractele cu efect inhibitor mai intens pentru a fi co-cultivate, în aceleaşi condiţii cu Candida albicans faringian. Pentru tulpina Candida recoltată de la purtatorul P 9, comparativ cu vâscul, toate celelalte extracte Melissa officinalis (Roiniţă) din Timişoara, Echinaceea purpurea (echinacea), Calendula oficinallis (gălbenele) au avut efect inhibitor mai intens decât extractul de vâsc controlul pozitiv (Hexoral). Îndeosebi extractele de Calendula officinalis (gălbenele) şi Echinaceea purpurea (echinacea) au indus inhibiţie de peste 70%. Nu au fost remarcate deosebiri semnificative între gradul de inhibiţie la 0,5% şi 7% la cele trei extracte active din plante medicinale. S-a confirmat faptul că extractul de vâsc e mai puţin activ (Tabel I.6.) 25

plante co-cultivate cu C. albicans faringian prelevat de la purtătorul P 9 Table I.6 Tabelul I 6. Valorile absorbanţelor la λ=560nm, comparativ pentru diferite concentraţii de extract de Absorbance values at λ=560nm, comparative for different plant extract concentrations cocultured with faringian C. albicans collected from bearer P 9 Denumire extract Extract name Durata (h) Period (h) Valorile absorbanţelor Absorbance values 0,5 3 7 VAM S 24 1,6±0,141 1,62±0,04 1,38±0,084 MELISSATIM 1,04±0,04 0,915±0,021 0,825±0,035 ECHINACEEA 0,58±0,028 0,52±0,049 0,425±0,04 CALENDULA 0,50±0,007 0,45 ± 0 0,35±0,063 CONTROL + 1,56±0,035 1,40±0,028 0,93±0,014 CONTROL- 2±0,028 VAM S 48 1,59±0,007 1,49 ±0,035 1,3±0,042 MELISSATIM 1,01±0,021 0,93±0,014 0,83±0014 ECHINACEEA 0,665±0,03 0,56±0,028 0,47±0,042 CALENDULA 0,68±0,014 0,58±0,042 0,35±0,049 CONTROL + 1,66±0,014 1,45±0,021 1,34±0,035 CONTROL- 2,2±0,021 VAM S 72 1,565±0,049 1,48±0,056 1,215±0,077 MELISSATIM 1,155±0,02 0,985±0,021 0,74±0,028 ECHINACEEA 0,36±0,014 0,34±0,007 0,25±0,00 CALENDULA 0,69±0,028 0,64±0,035 0,53±0,049 CONTROL + 1,48±0 1,27±0,007 1,20±0,021 CONTROL- 2,4±0 26

Concluzii Acţiunea inhibitoare a extractului de Echinaceea purpurea (echinacea) şi Calendula oficinallis (gălbenele) sunt similare, la toate intervalele de co-cultivare şi nu depend de doză. Intensitatea inhibiţiei este apropiată de a hexoralului. Semnificativ mai redus este efectul antifungic al extractului de Melissa officinalis (Roiniţă) din Timişoara în acest caz, şi minim pentru extractul de Viscum album (vâsc). Comparativ cu controlul pozitiv, la 24 şi 48 de ore sunt mai inhibitoare, dar la 72 de ore devin aproximativ egale. Modul experimental 6 Tinând seama de rezultatele obţinute în modulul experimental 1 şi 2, în acest modul s-au utilizat extracte de busuioc + coriandru (1:3) (extract A 3 ), comparativ cu extracte de salvie+rozmarin (1:3) (extract A 4 ). Tabelul IV.14 include valorile absorbanţei obţinute la λ=560nm, comparativ pentru hexoral, amestecuri vegetale A 3, A 4 co-cultivat cu tulpina de Candida albicans vaginală prelevată de la purtătorul P 11, comparativ cu controlul pozitiv şi negativ. Gradul de inhibiţie al amestecuri de extracte vegetale A 3 si A 4 comparativ cu controlul negativ, exprimat în procente, după 24, 48 şi 72 ore de co-cultivare cu C. albicans vaginal este reprezentat în figura I.8. 100 80 60 Grad de inhibiţie (%) Inhition degree (%) 40 20 0-20 -40-60 -80 A3 A4 CONTROL+ -100 24 h 48h 72h 8 24 h 48h 72h 0,2% 8% PURTĂTOR P11/BEARER 11 Figura I.8. Gradul de inhibiţie al celor două amestecuri de extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans recoltat de la purtătorul P 11 Fig. I.8. The degree of inhibition (%) of two vegetal extracts co-cultured with C. albicans collected from P11 bearer 27

Determinările cantitative efectuate în modulule experimentale 1-6 au permis evidenţierea acţiunii antifungice a extractelor de plante medicinale, unele din ele similare cu ale preparatului hexoral, la concentraţii similare. De remarcat: 1. Extractele pe baza de coriandru şi busuioc au avut acţiune intens antifungică faţă de tulpinile de Candida faringian şi vaginal 2. Extractele de Echinaceea, calendula şi sunătoare au avut efect intens inhibitor asupra tulpinilor de Candida faringian 3. Extracţia în hidroglicerină are efecte similare cu extractul hidroalcoolic şi este recomandabil, ţinând cont de lipsa toxicităţii glicerinei faţă de alcool 4. Extractele de vâsc au efect inhibitor semnificativ mai slab decât al plantelor medicinale. Totuşi extractul recoltat de pe stem de vâsc de măr a avut acţiune inhibitoare mai mare decât extractele similare de vâsc din frunze sau alte plante (salcâm). 5. S-au remarcat efecte reproductibile ale aceloraşi extracte testate pe tulpini recoltate din zona faringiană sau vaginală. 6. Efectele au avut o dependenţă de doza aplicată în unele cazuri (excepţie făcând extractele intens antifungice unde şi dozele mici au indus efect semnificativ) şi au demonstrat acţiunea antifungică optimă pe intervalul de tratament de 48-72 de ore. 7. Efectul amestecurilor A 3 şi A 4 este similar cu efectul Hexoralului, si este similar după 72 de ore, nu depinde de concentraţie (0, 2% sau 8%). În acest caz, spre deosebire de modulul experimental 2, extractul de salvie cu rozmarin a fost mai eficient, ca inhibitor al tulpinii. Se poate aprecia că aceste amestecuri de extracte vegetale pot fi folosite ca agenţi antifungici în tratamentul candidozelor, mai ales în cazul candidozelor rezistente la tratamentul antifungic clasic. 28

Evaluare calitativă (pe mediu solid) Aspectul morfologic al tulpinilor de C. albicans recoltate de la purtătorii investigaţi (P1 P11) Figura I.9. a şi b reprezintă aspectul morfologic macroscopic al tulpinilor de C. albicans cultivate pe mediu de cultură solid (a) şi recoltate de la purtători (b) a. Fig. I.9. a. Aspectul morfologic macroscopic al tulpinilor de C. albicans cultivate pe mediu de cultură solid Fig. I.9. a. Morphologic aspect of C. albicans strains cultivated on solid culture media Coloniile de Candida albicans au avut o creştere rapidă pe mediul solid. Aspectul macroscopic al culturilor: colonii rotunde, mici, de culoare crem sau crem-galbuie, reliefate, convexe, umede lucioase, de consistenţă cremoasă, ca untul, neaderente de mediu ce trimit filamente fine în profunzimea mediului. Identificarea fungilor patogeni a fost efectuată prin examenul microscopic direct al probelor patologice prelevate de la purtători şi prin colorarea frotiurilor. Produsul patologic recoltat în condiţii sterile s-a examinat la microscop, cu obiectivul cu imersie. Celulele levurice gen Candida apar ca formaţiuni rotunde, ovalare. În câmpul microscopic apar strălucitoare, unele având muguri, fapt care le diferenţiază de orice alt element. Dimensiunile celulelor variază: diametrul lor fiind de 2-3 microni la celulele tinere, ceva mai mare la celulele mature. Pentru examinarea la microscop s-au folosit fie suspensii din cultură, fie mici eşantioane. Figura I.10 a-d reprezintă aspectul microscopic al tulpinilor de C. albicans identificate la purtători. 29

a. b. Fig. I. 10. Aspect microscopic al celulelor fungice a.gram pozitivă b. nativ Fig. I. 10. Microscopic aspect of fungic cells a.gram positive coloration b nativ Aspectul microscopic al culturilor era de,,pietre în pavaj : Celule levurice (blastospori) de 2-4 microni diametru, rotunde sau ovalare, multe în curs de înmugurire; filamente (filamentarea este caracteristică pentru Candida); clamidiospori (numai la Candida albicans)-celule sferice de 20-22 microni diametru, refringente, cu dublu contur, ce se găsesc la extemitatea unor ramuri pseudomiceliene. Se produc atunci când cultura de Candida a fost trecută pe mediul P.C.B. După examinare s-a ridicat obiectivul, s-a şters uleiul de cedru de pe obiectivul cu imersie şi s-a scos lama de pe platina microscopului. Evaluarea efectului antifungic Pentru a stabili un sistem rapid, screening de evaluare a efectului antifungic al diferitelor extracte, am selectat extractele care au dovedit acţiune inhibitoare in vitro, prin determinări cantitative şi le-am utilizat, la concentraţii de 7-8 % pentru a identifica, pe mediu solid gradul de inhibiţie. Au fost acordate scoruri de la + la +++, în funcţie de numărul coloniilor de Candida care s-au dezvoltat după însămînţare cu tulpina Candida şi/ sau după tratamentul cu extracte vegetale. Tabelul IV.15. reprezintă dinamica de inhibiţie celulară (+ = inhibiţie minimă, +++ = inhibiţie maximă), a tulpinii C. albicans în funcţie de concentraţia fiecărui extract ce s-a folosit ca tratament. Se observă că cea mai eficientă concentraţie a extractului vegetal este cea mai mare (8%), cu excepţia extractului de Calendula oficinallis (gălbenele), Echinaceea purpurea (echinacea) şi Ocimum basilicum (busuioc) care au fost eficiente şi la 7%. O relaţie proporţională cu durata incubării a fost observată pentru Echinaceea purpurea (echinacea), coriandru, coacăze negre şi busuioc, dar nu şi pentru Calendula oficinallis (gălbenele), a cărei actiune nu a depins de durata incubării. 30