2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Activitatea enzimatica = modificari timp = c min = A min l Activitatea pe litru ser = A min l Volumul total din cuva Volumul de enzima X 1000 Act. enzimatica din ser - U/L Act. enzimatica - µmol min -1 L -1
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Colorimetric Fluorimetric
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode turbidimetrice http://namrataheda.blogspot.ro/2013/07/ Măsurarea activității enzimatice a lipazei din S.aureus Rollof, J. et al., Acta path. Microbiol. Immunol. Scand., Sect.B, 92, 155-158, 1984
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode turbidimetrice Fara ioni Hg2+ SEM a celulelor de Acetivibrio cellulolyticus Xu, Qi. et al., J. Bacteriol, 5782, Sept. 2004, Ca2+ Măsurarea activității celulazei din Acetivibrio cellulolyticus MacKenzie, J. et al., Appl. Env. Microb., 50(2), 243-248, 1985 Strcutura architecturala cellulozomului din Acetivibrio cellulolyticus Hamberg Yet al. 2014,. PeerJ 2:e636
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode turbidimetrice - standarde Formazin (standarde de turbiditate) https://www.globalspec.com/ hach.com 1926 turb. albumina din urina 1 FTU 1,25 mg/l+ 12,5 mg/l HMT HMT hexametilentertamina Obținerea formazinei https://chemistry.stackexchange.com
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode turbidimetrice Reducerea Insulinei de către PDI Smith et al., J. Mol. Screen, 9(7), 614-620 Concentrația PDI variabiliă Optimizarea concentrației Insulinei pentru metoda turbidimetrică Smith et al., J. Mol. Screen, 9(7), 614-620 Concentrația PDI variabiliă
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode nefelometrice https://www.pinterest.co.uk/ Măsurarea activității celulazei din Trichoderma reesei Mummi, M., J. et al., Anal. Biochem., 116, 133-136, 1981
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode nefelometrice trends.directindustry.com/ Măsurarea activității enzimelor pancreatice II. Lipase Zinterhofer., L. et al., Clin. Chim. Acta, 44, 173-178, 1987
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Luminometria Firefly (Photinus pyralis) Etichetarea cu FITC a compușilor cu NH 2
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Luminometria Yaiza, P. Et al., Overweight in the Elderly Induces a Switch in Energy Metabolism that Undermines Muscle Integrity
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Luminometria https://www.etsy.com/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Luminometria Detecția glutamatului prin reacții enzimatice Zakir Hossain, S.M.. et al., Biotech Rep, 9, 57-65, 2016 Reprezentare schematică de eliberare a glutamatului din celule C6 de către toxine (acid ibotenic) Zakir Hossain, S.M.. et al., 2016 https://www.shimadzu.com/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Polarimetria Hidroliza zaharozei folosind soluții de diluții 1:250, 1:500, 1:1000 de invertază din drojdie McIntosh,. K.A. et al. (1998), J. Pharm. Biomed. Anal., 17, 1037-1045
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode electrochimice Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany Ramsay, R. R. and Tipton, K. F. (2017) Molecules, 2017, 22, 1192
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Metode potențiometrice NAD(P) + /NAD(P)H FAD/FADH 2 Fe 2+ /Fe 3+ (citocrom). Detecția potențiometrică a pesticidelor organofosforice Zdrachek, E. and Baker, R., Anal CHem, 2019, 91, 2-26
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Etichetarea radioactivă Disfuncții ale intestinului pentru pacienți cu EED https://www.pinterest.co.uk/pin/ Metodă discontinuă de măsurare a activității enzimatice (P pe filtru) Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis, Capitol 1, Willey & Sons (1998)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Etichetarea radioactivă
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice Alte metode Separarea substratului și produșilor unei reacții catalizate de adenozin kinaza pe HPLC (fază inversă) Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis, Capitol 1, Willey & Sons (1998)
2.5. Monitorizarea activității enzimatice 2.5.3. Evaluarea calității preparatelor enzimatice Parametri: Activitatea Puritatea Stabilitatea Modul de preparare/împachetare activitatea specifică activitatea catalitică /conținut de proteină totală. U/mg sau U/g Fractions Total activity (U) Total protein (mg) Lipaza Specific activity (U/mg) Purification fold Yield (%) Crude 139.4 3.84 36.28 1 100 A.S. fraction a (35-45.21 1.17 38.7 1.07 32.43 85%) PEG fraction b (20% w/w) 74.07 0.54 138.3 3.81 53.14
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor izoterma Freundlich m = k 1 C k 2 izoterma Langmuir k 1 k 2 C m = 1 + k 2 C
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor imobilizarea prin adsorbție și includere a enzimelor Cantitatea de enzimă adsorbită - parametri: Concentrația soluției enzimei care este supusă imobilizării Timpul de contact T incubare Influența ph-ului www.easybiologyclass.com
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor imobilizarea prin adsorbție a enzimelor Suporturi utilizate Suport mineral (Al 2 O 3, argilă) Suport organic (amidon) Sefaroză modificată Rășini schimbătoare de ioni https://www.intechopen.com Interacțiunilor slabe interacțiuni electrostatice hidrofobe punți de hidrogen Mărimea particulelor D = 500 nm 1 mm
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor imobilizarea prin includere a enzimelor Sechestrarea enzimelor într-o matrice Matricea polimeri solubili în apă Exemple de matrici Geluri de poliacrilamidă Triacetat de celuloză Agar-agar Gelatină Caragenan alginate
Imobilizarea acilazei Illanes, A. & Valencia, P, Industrial an Therapeutic enzymes: Penicillin acylase, Capitol 13, Current Developments in Biotechnology and Bioengineering (2017) 2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor Imobilizarea acilazei Cao, L. et al., J Mol Cat B: Enzymatic 11(4 6), 2001, 665
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor încapsularea în lipozomi https://application.wiley-vch.de
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode fizice de imobilizare a enzimelor imobilizarea prin includere a enzimelor Avantaje - dezavantaje Variază forma și natura matricilor Dimensiunea porilor matricii poate fi ajustată Posibile scăpări ale enzimelor cu M mică Agarul și caragenanul dimensiuni mari - pori Dimensiunea porilor poate fi ajustată variind conc polimerului Metoda nu poate fi utilizată în procesele industriale Preferată pentru experimente la scară mică
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Materialele (pentru imobilizare)caracteristici: suprafață compatibilă cu a enzimei; grupări reactive pentru atașarea enzimelor; capacitate mare de legare; inertă față de componenții reacției enzimatice; stabilitate mare în condițiile optime ale reacției enzimatice
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Formarea de legături covalente între enzimă și suport Metodă preferată de imobilizare Grupări chimice care pot forma legături covalente cu suportul Grupări amino, imino Grupări -OH Grupări -COOH Grupări SH și SCH 3 Grupări guanidil și imidazol Nuclee fenolice
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Matrici / suporturi utilizate în legarea covalentă a enzimelor: Carbohidrați: celuloză, DEAE celuloză, agaroză Agenți sintetici: poliacrilamidă Proteine (colagen, gelatină, albumină) Matrici cu grupări amino: amino-benzil-celuloză Suporturi anorganice: sticlă poroasă, silicagel CNBr-agaroză și CNBr-Sepharose Grupările OH și NH2 formează mai ușor legături covalente
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Metode de legare covalentă Diazotare Gr NH 2 suport Y sau H din enzimă Formarea legături peptidice NH 2 suport HOOC- din enzimă Illanes, Enzyme Bocatalysis. Principles and applications, Springer (2008)
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Metode de legare covalentă
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Metode de legare covalentă Utilizarea agenților polifuncționali Portman, R.(2008), Biology of Metals, 22(2):363-375
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor Legarea covalentă a enzimelor Metode de legare covalentă 2 agenți agenți polifuncționali Maryskova, M. et al. Enzyme and Microbial Technology 89, 2016, Pages 31-38
2.6. Imobilizarea enzimelor a) Metode chimice de imobilizare a enzimelor reticularea enzimelor Metode de legare covalentă
2.6. Imobilizarea enzimelor Aplicații ale enzimelor imobilizate Producerea industrială a antibioticelor băuturilor aminoacizilor Aplicații biomedicale Industrie alimentară Cercetare tratament diagnoză eliberare medicamente gemuri jeleuri siropuri HPR experimente blotting proteaze lizare celulară
2.6. Imobilizarea enzimelor Aplicații ale enzimelor imobilizate Producerea biodieselului din uleiuri vegetale Managementul apelor reziduale tratarea apelor de canal tratarea efluenți industriali Industrie textilă Industria detergenților degresare bio-netezire dezmembrare țesături imobilizare lipaze îndepărtarea murdăriei