Microsoft Word - RST etapa I INSERP.doc

Transcriere

1 RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC Proiect: NOI PRODUSE CU ACTIUNE ANTIALERGICA SI ANTIINFLAMATOARE PE BAZA DE INHIBITORI NATURALI AI SERIN-PROTEAZELOR Contract nr /2008 Etapa I/februarie 2009 Director proiect Dr. chim. Lupescu Irina Responsabili stiintifici CS II chim. Eremia Mihaela Conf. dr. Rosu Ana Ing. Cozea Andreea

2 1. OBIECTIVELE ETAPEI Elaborarea stategiei de obtinere a unor polipeptide inhibitoare ale serin-proteazelor, din materii prime vegetale: organe specializate ale plantelor intacte sau culturi de celule vegetale induse de la Ńesuturile organelor specializate Pentru atingerea obiectivului sus-mentionat s-a prevazut pentru aceast etapa realizarea de studii documentare si experimentale preliminare privind: (1) extractia din surse vegetale si purificarea unor polipeptide inhibitoare ale serinproteazelor (Partener 1) (2) caracterizarea compozitiei chimice a surselor vegetale de inhibitori de serin-proteaze (Partener 4) (3) biosinteza in vitro a unor inhibitori de serin-proteaze (Partener 2) (4) imbunătăńirea activităńii specifice a polipeptidelor inhibitoare de serin-proteaze, prin hidroliza lor partiala (CO) (5) diseminare prin relizarea unei pagini web (CO): 2. REZUMATUL ETAPEI In acest capitol sunt prezentate pe scurt cercetarile efectuate de catre fiecare partener, in conformitate cu activitatile prevazute pentru aceasta etapa (I/2009) in planul de realizare al proiectului. Partener 1, INCDCF-ICCF - Studii documentare şi experimentale preliminare privind extracńia din surse vegetale şi purificarea unor polipeptide inhibitoare ale serinproteazelor In cadrul studiilor documentare efectuate s-au evidentiat caracteristicile structurale ale polipeptidelor de origine vegetală cu activitate inhibitoare asupra serin-proteazelor, criteriile de clasificare a acestora, precum si importanńa studierii acestora pentru domeniul medical. Din analiza critica a datelor de literatura a reiesit ca cele mai multe studii privind inhibitorii de proteaze vegetali s-au efectuat pe soia. Acestea au arătat prezenńa a două tipuri de inhibitori şi anume: inhibitorul Kunitz cu masă moleculară 20-25kD şi activitate specifică asupra 2

3 tripsinei, cunoscut ca Soybean Trypsin Inhibitor (STI) şi inhibitorul Bowman-Birk (BBI) cu masă moleculară 6-10kD şi specificitate redusă, inhibând simultan tripsina şi chimotripsina. Pe baza studiilor documentare referitoare la metodele de extractie a inhibitorilor din materii prime vegetale si de purificare a acestora s-a elaborat un protocol experimental care s-a aplicat in cazul semintelor a trei tipuri de plante: in (Linum usitatissimum), pepene verde (Citrullus vulgaris) şi hrişcă (Fagopyrum esculentum), obtinandu-se in final trei preparate proteice lichide, dupa cum urmeaza: SoluŃie proteică din seminńe de in (Linum usitatissimum) cu o activitate inhibitoare serinproteazică de 504,5 UI/ml; SoluŃie proteică din seminńe de pepene verde (Citrullus vulgaris, Citrullus lanatus) cu o activitate inhibitoare serin-proteazică de 820,8 UI/ml; SoluŃie proteică din seminńe de hrişcă (Fagopyrum aesculentum) cu o activitate inhibitoare serin-proteazică de 856,96 UI/ml. Partener 4, Hofigal S.A. - Caracterizarea compozitiei chimice a surselor vegetale de inhibitori de serin-proteaze S-a efectuat o documentare ampla asupra surselor vegetale de potentiali inhibitori ai serin proteazelor, surse care sa permita realizarea de concentrate naturale bogate in inhibitori de serin proteaze cu utilizare in diferite fitopreparate (fitofarmaceutice, cosmetice, alimentare). In selectarea acestor surse bogate in inhibitori de serin proteaze s-a avut in vedere atat posibilitatea asigurarii lor in cantitati suficiente pentru un anumit nivel de productie la scara industriala, precum si aspectele de ordin economic privind costurile de la cultivare pana la procesarea finala. Pe baza analizei efectuate asupra datelor din literatura de specialitate cu privire la inhibitorii naturali din plante ai serin proteazelor, s-au propus pentru a fi studiate in etapele viitoare ca potentiale surse de inhibitori, urmatoarele plante si organe de plante: Mormordica charantia - castravetele amar - fruct si seminte, Cucurbita pepo-dovleacul - fruct si seminte, Citrullus vulgaris - pepene verde, specii pentru care s-a evidentiat si compozitia chimica. Partener 2, Biotehgen - Biosinteza in vitro a unor inhibitori de serin-proteaze In studiile experimentale preliminare privind biosinteza unor inhibitori tripazici in culturi celulare s-a ales o specie care se bucura de o popularitate speciala in medicina pupulara din multe tari, Momordica charantia, din familia Cucurbitaceae. Atat fructul cat si frunzele si semintele sunt apreciate pentru efectul pozitiv in tratarea diabetului, a inflamatiilor, alergiilor, a leucemiei, cancerului si ca imunostimulant. Activitatea antivirala a fitochimicalelor din aceasta planta a fost demonstrata in cazul a numeroase virusuri, 3

4 inclusiv virusul Epstein-Barr, herpes si HIV. A demonstrat totodata activitate antibacteriana pentru E. coli, Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella, Streptobacillus, Helicobacter pylory, si anti protozoara in cazul Entamoeba histolitica. Pe langa proteinele α si β-momocardin, momordin si cucurbitacin B, care au exprimat activitate anticanceroasa si antileucemica, o atentie speciala se acorda in prezent si identificarii recente a unor inhibitori Bowman-Birk si de tip Squash de serin-proteaze. Cercetarile efectuate in aceasta etapa au condus la stabilirea conditiilor optime de stimulare a proliferarii celulare si dezvoltarii de calusuri de la diferite tipuri de explante: cotiledoane, frunze, epicotil, hipocotil si radacini. Manipuland compozitia mediului de cultura in ce priveste suplimentul hormonal si conditiile de incubare, testarile efectuate au condus la stabilirea formulelor optime pentru inducerea calusului de la diferite tipuri de explante somatice si pentru mentinerea culturilor de calus pe termen lung. CO USAMV, Bucuresti - ImbunătăŃirea activităńii specifice a polipeptidelor inhibitoare de serin-proteaze, prin hidroliza lor partiala Studiile documentare privind mecanismul inhibitiei produse de polipeptidele de origina vegetala asupra serin-proteazelor au evidentiat importanta anumitor secvente din structura inhibitorilor si a conformatiei spatiale a acestora asupra efectului inhibitor. Astfel, s-a demonstrat ca triptazele sunt o familie de serin-proteaze specifice mastocitelor, care au proprietatea de a scinda legaturi peptidice in care sunt implicate grupele carboxil ale aminoacizilor bazici ca Arg sau Lys. Aceste enzime sunt active in forma unui homotetramer necovalent, in care monomerii sunt pozitionati in colturile unui patrat, cu situsurile active orientate catre un por central. Acest por central restrange accesul substraturilor macromoleculare la situsurile active, ceea ce confera triptazelor o specificitate de substrat distincta, bazata pe preferinta pentru peptide cu masa moleculara mica si o rezistenta marita fata de inhibitorii de proteaze cu mase moleculare mari. Din acest motiv, ca o prima solutie pentru imbunatatirea efectului inhibitor s-a incercat diminuarea masei moleculare a unui inhibitor obtinut experimental, prin hidroliza partiala. In acest scop am obtinut un catalizator enzimatic stabilizat cu ajutorul caruia sa se poata realiza ulterior o hidroliza partiala a inhibitorului de tip BBI obtinut experimental, fara a afecta situsurile active ale acestuia. Pentru proteoliza limitata a inhibitorilor BBI am ales termolizina, deoarece specificitatea de substrat a acestei metaloproteaze nu include legaturile peptidice implicate in situsurile active ale acestor inhibitori, astfel incat este posibila hidroliza lor partiala fara a afecta structura responsabila de legarea serin-proteazelor. 4

5 Pentru imobilizarea termolizinei s-au folosit mai multe metode şi anume: adsorbńia fizică, legarea ionică şi legarea covalentă. În cazul adsorbńiei fizice s-au testat răşinile adsorbante Amberlite XAD-7 şi 8, răşini pe bază de poliacrilańi, care au o capacitate remarcabilă de fixare a proteinelor, datorată interacńiilor hidrofobe. Pentru imobilizarea prin cuplare covalentă s-a utilizat ca suport un polimer sintetic, cunoscut sub denumirea de Eupergit C, a cărui matrice este formată prin copolimerizarea metacrilamidei cu N.N - metilen-bis(metacrilamida) şi un component conńinând o grupă oxiran reactivă (glicidil metacrilat şi/sau alil glicidil eter). Cercetările experimentale efectuate au condus la obtinerea unor randamente de imobilizare a termolizinei active de 75% in cazul adsorbtiei pe XAD 7 urmata de reticulare cu glutaraldehida si 60% prin legare covalenta de Eupergit C. Biocatalizatorul astfel obtinut se va utiliza pentru hidroliza partiala a unui inhibitor de tip BBI de serin-proteaze, urmarindu-se realizarea unei proteolize limitate, fara afectarea situsurilor de legare de proteaza tinta si obtinerea unei polipeptide de dimensiuni reduse cu efect inhibitor imbunatatit. 5