PowerPoint Presentation

Transcriere

1 structurale mecanice transport canale pompe Functiile proteinelor 3/4 din capacitatea totala de tamponare a organismului Control ph

2 Hemoglobina Structura cuaternara 4 subunități Tipuri HbA 2 β 2 96% Hb adult 25 % nou-născut HbA 1c 2 β 2 glicozilată (subunitatea β NH 2 -Val) HbA 2 2 δ 2 5% Hb adult sănătos 5% Hb diabetici 2-3% Hb adult sănătos 3% β-talasemia Deoxihemoglobina A PDB 1HBB HbF 2 2 1% Hb adult 75 % nou-născut HbF~O 2 > HbA~O 2

3 Hemoglobina Anemia falciformă (siclemia) HbS 2 β 2 β GLU6VAL anemia-falciforma.html acces restrâns al O 2 la HbS Oboseala

4 Proteine masa moleculară

5 Tehnici de separare si caracterizare a proteinelor Studiul proteinelor -obiective prepararea extractului precipitarea dializa ultrafiltrarea centrifugarea separarea cromatografica verificarea puritatii

6 1.1. Prepararea extractului Alegerea sursei microorganisme tutun plante muscată Spanac Procariote (archea, eubacterii) Eucariote Drojdii Fungi origine animală Arabidopsis thaliana Ficat, pancreas, creier

7 1.1. Prepararea extractului 1. Purificarea proteinei ultrasonicare Ruperea membranelor celulare utilizarea presei franceze cicli inghetare-dezghetare enzimatic folosirea detergenților

8 1.1. Prepararea extractului ultrasonicare presa franceza celulele procariote eucariote țesuturi animale zgomotoasă reproductibilitatea (denaturare) celulele bacteriene P = psi (1360 atm) V min = 40mL samples scumpă zgomotoasă timp îndelungat funcționare/curățire

9 1.1. Prepararea extractului cicli inghetare-dezghetare distrugerea membranei celulare - Utilizarea lizozimului - Utilizarea detergentilor joy-of-bioprocess.blogspot.com celulele bacteriene animale + ieftină reproductibilitatea (denaturare)

10 1.2. Precipitarea proteinelor A. Precipitarea la ph = pi Papaina (papaia) pi = 8,85 Ureaza (fasole) pi = 5-5,1 B. Precipitarea cu (NH 4 ) 2 SO 4 precipitat Precipitarea fractiunilor care contin HSA a) Inainte de adaugarea sarii; b) Suspensie de precipitat proteic in solutie 85% de sulfat de amoniu; c) Precipitat proteic rezultat in urma centrifugarii (60 min la 5000 rpm).

11 1.2. Precipitarea proteinelor C. Precipitarea cu PEG D. Precipitarea cu solventi organici Acetona EtOH 1.3. Dializa Amestec supus dializei difuzie A Proteina B Sac de dializa Molecule mici Solutie tampon

12 1.3. Dializa îndepărtarea sărurilor/solvenților organici Saci de dializa (esteri celuloza)

13 1.4. Ultrafiltrarea (concentrarea probei) Membrane semipermeabile - Acetat de celuloza - Nylon - polivinilidena N 2 (presiune) Mai rapida decat dializa Concentrarea probei Solutia de proteina supusa concentrarii Sticla sinterizata Magnet pentru agitare Membrana Agitator magnetic Ultrafiltrat

14 1.4. Ultrafiltrarea (concentrarea probei) Membrane semipermeabile/centrifugare Membrane semipermeabile -presiunewww.ebay.tv

15 1.5. Centrifugarea Precede alte operatii sonicare precipitare r Separarea M forma densitate natura solventului Viteze mici < 6000 rpm Particule mai mari nucleu celule rosii

16 1.5. Ultracentrifugarea Viteze mari > rpm Organite celulare mitocondrii reticulul endoplasmatic 1 Svedberg = 1S = 1 x s Hemoglobina 4,5 S Mioglobina 1,8 S Procariote Eucariote

17 1.5. Centrifugare vs ultracentrifugarea

18 1.5. Ultracentrifugarea

19 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de excludere Amestec supus separarii Coloana cromatografica A Gel B

20 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de permeabilitate in geluri Tipul gelulului Intervalul de separare (M, KDa) Sephadex G-10 < 0.7 Sephadex G Bio-Gel P Sephadex G Sephadex G Bio-Gel P Sephadex G Sephacryl S Sepharose 2B Estimarea masei moleculare relative M r MW/kDa Volume/ml

21 Superdex 200 Increase 10/300 GL Separarea cromatografica Cromatografie de permeabilitate in geluri Sistem de purificare cromatografică

22 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de permeabilitate in geluri Avantaje Timp scurt de analiză; Separare bine-definită; Benzi înguste și sensibilitate bună; Nu există pierderi ale compusilor separați; Volum mic de fază mobilă ; Rată de eluție controlabilă. Etapă finală la purificarea proteinelor Separare cromatografica HiLoad 16/60 Superdex 200 HEPES 50 mm ph mm NaCl) Zaharia, M. & Gradinaru, R., J. Appl. Spectrosc., 82 (2), (2015)

23 1.6. Separarea cromatografica 1. Purificarea enzimei Cromatografie prin interactii hidrofobe Cromatografie mixtă hidrofobă + ionică

24 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de schimb ionic Proteina A Ioni din tampon Schimbator anionic B

25 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de schimb ionic ww.bio-rad.com/webroot

26 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de schimb ionic Grupări functionale ale schimbatorilor de ioni Schimbatori anionici Gruparea functionala Taria schimbatorului Dietil-amino-etil (DEAE) -O-CH 2 -CH 2 -N + ( CH 2 CH 3 ) 2 slaba Cuaternara aminoetil -O-CH 2 -CH 2 -N + ( C 2 H 5 ) 2 - CH 2 -CH 2 OH-CH 3 puternica (QAE) Cuaternara amoniu (Q) -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -N + (CH 3 ) 3 puternica Schimbatori cationici Gruparea functionala Taria schimbatorului Carboximetil (CM) -O-CH 2 -COO - slaba Sulfopropil (SP) -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 - CH 2 - CH 2 -SO - 3 puternica Sulfonat de metil -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 - CHOH- CH 2 -SO - 3 puternica

27 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de afinitate

28 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de afinitate ADN cu secventa suplimentara Insertie in bacterii (E coli) Indepatare secventa suplimentara Spalare Elutie proteina cu secventa adiacenta alte proteine Distrugerea membranelor legare Matrice de afinitate = ligand

29 1.6. Separarea cromatografica Cromatografie de afinitate aplicații Purificarea acizilor nucleici Purificarea proteinelor membranare Purificarea enzimelor Purificarea anticorpilor Purificarea receptorilor (pentru hormoni) Purificarea proteine neurotransmiţătoare

30 1.6. Verificarea puritatii - electroforeza kda 66 kda 45 kda MW/kDa kda 20 kda 14 kda distance/mm

31 1. Purificarea proteinelor 1.6. Verificarea puritatii SDS electroforeza SDS (detergent) solubilizeaza aproape toate proteinele; Avantajele SDS electroforezei Micelele de SDS-proteina, fiind puternic incarcate negativ, poseda o mobilitate electroforetica; Lanturile polipeptidice sunt despachetate separarea = f(dimensiune a porilor, M); Proteinele separate prin SDS-electroforeza - leaga bine colorantul. Dezavantaje Izoproteinele nu apar sub forma unor benzi diferite;

32 1.6. Verificarea puritatii - electroforeza Sisteme de electroforeza folosite (cu detergent) Tris-glycine SDS PAGE (Laemmli) 7.5% kda 12.5% kda 20% 3-25 kda Tris-Tricine SDS PAGE (Schaegger) 16.5% 2-25 kda Sisteme de electroforeza nativa - fara SDS - agenti reducatori (DTT)

33 1.6. Verificarea puritatii - electroforeza Sisteme de electroforeza folosite

34 1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza Mecanism de polimerizare

35 1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza Mecanism de polimerizare Acrilamida (%) Intervalul de separare (KDa) , ,

36 1.6. Verificarea puritatii SDS - electroforeza Reducerea puntilor disulfidice

37 1.6. Diagnoză - electroforeza Reducerea puntilor disulfidice

38 1.6. Verificarea puritatii electroforeza bidimensională

39 1.6. Separarea proteinei - HPLC verificarea puritatii dionex.com elte.prompt.hu

40 1. Puritatea proteinei / complecsi 1.6. Spectrometria de masa determinarea masei moleuclare

41 1. Puritatea proteinei / complecsi 1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (MALDI-TOF)

42 1. Puritatea proteinei 1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS)

43 1. Purificarea peptidelor/proteinelor 1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS)

44 1. Analiza proteinei 1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa in tandem Proba Sursă de ionizare MS1 Fragmentare (cameră de coliziune) MS2 Detector EI, ESI MALDI Spectru de masă 1 Spectru de masă 2

45 1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa in tandem AA M (Da) AA M (Da) AA M (Da) AA M (Da) Ala, A 71.0 Gln, Q Leu, L Ser, S 87.0 Arg, R Glu, E Lys, K Thr, T Asn, N Gly, G 57.0 Met, M Trp, W Asp, D His, H Phe, F Tyr, Y Cys, C Ile, I Pro, P 97.1 Val, V 99.1

46 1.6. Verificarea puritatii spectrometria de masa (ESI-MS) Aplicatiile MS Caracterizarea proteinelor recombinate Modificarile postranslationale ale proteinelor Identificarea proteinelor (2D gel) Expert Protein Analysis System ExPASy Determinarea masei moleculare Proba din ficatul uman 1- si -globine ( 12 KDa); 2- -actine ( 12 KDa) 3- acetil colin esteraza; 4- spectrine cu lant -actine