RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC Proiect: NOI PRODUSE CU ACTIUNE ANTIALERGICA SI ANTIINFLAMATOARE PE BAZA DE INHIBITORI NATURALI AI SERIN-PROTEAZELOR Contract nr. 62-075/2008 Etapa II/noiembrie 2009: Stabilirea conditiilor optime de extractie a inhibitorilor din surse vegetale Director proiect Dr. chim. Lupescu Irina Responsabili stiintifici CS II chim. Eremia Mihaela Conf. dr. Rosu Ana Ing. Cozea Andreea
1. OBIECTIVELE ETAPEI În cadrul obiectivului general al etapei de cercetare la care se referă prezentul raport constând din Stabilirea condińiilor optime de extracńie a inhibitorilor din surse vegetale, s- au prevăzut în planul de realizare a proiectului următoarele obiective specifice ale etapei: 1. Studiul documentar (Partener 3) privind: a) cromatografia de afinitate b) obtinerea efectorului afin (tripsina imobilizata) pentru purificarea prin aceasta tehnica a inhibitorilor proteazici. 2. Studiul experimental privind obtinerea efectorului afin - tripsina imobilizata pe suport biopolimeric chitosan (Partener 3) 3. Cercetari preliminare referitoare la elaborarea unui model experimental privind obtinerea de culturi celulare vegetale pentru demonstrarea totipotentei biochimice privind inhibitorii cercetati (Partener 2) 4. Experimetare la nivel de laborator a diferitelor metode de extractie a inhibitorilor din surse vegetale (Partener 4) 5. Experimentarea la nivel de laborator a diferitelor metode de extractie si purificare partiala a inhibitorilor din surse vegetale (Partener 1) 6. Experimentarea unor metode de hidroliza partiala controlata a inhibitorilor purificati si caracterizarea compusilor obtinuti (CO) 2. REZUMATUL ETAPEI In acest capitol sunt prezentate pe scurt cercetarile efectuate de catre fiecare partener, in conformitate cu activitatile prevazute pentru aceasta etapa (II/2009) in planul de realizare al proiectului. Partener 3, INCDSB Studii documentare si experimentale preliminare privind utilizarea cromatografiei de afinitate pentru purificarea si caracterizarea inhibitorilor. In cadrul acestei activitati s-au efectuat: 1. Studiul documentar privind: - cromatografia de afinitate 2
- obtinerea efectorului afin (tripsina imobilizata) pentru purificarea prin aceasta tehnica a inhibitorilor proteazici 2. Studiul experimental privind obtinerea efectorului afin tripsina imobilizata pe suport biopolimeric chitosan Pentru consultarea datelor recente din literatura de specialitate privind cromatografia de afinitate in general si obtinerea efectorului afin pe baza de tripsina imobilizata s-a accesat baza de date: Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, http://www.sciencedirect.com, www.springerlink.com/journals, www.scopus.com. Pe baza analizei datelor de literatura, s-au selectat si s-au realizat 2 modele experimentale de imobilizare a tripsinei in gel de chitosan: 1. Includere in gel de chitosan, reticulare cu glutaraldehida (GA) si reducere cu borohidrura de sodiu pentru obtinerea preparatului enzimatic imobilizat sub forma de granule. 2. Adsorbtia pe granule de chitosan activat cu carbodiimida (CDI). Prin aplicarea modelelor experimentale sus-mentionate s-au obtinut urmatoarele rezultate: - tripsina s-a imobilizat cu un randament de 89% prin metoda adsorbtiei pe chitosan activat cu carbodiimida si cu un randament de 3,33% prin includere in gel si reducere cu borohidrura de sodiu. Probele au fost predate spre testare la partenerul 1 (INCDCF-ICCF) si au condus la rezultate seminificative privind purificarea unor inhibitori serin-proteazici vegetali. Rezultatele au fost comunicate in lucrarea: Efectori afini pentru purificarea partiala a proteinelor vegetale potentiali inhibitori serin-proteazici, autori: Luminita Tcacenco (P3), Mihaela Eremia (P1), Elena Berteanu (P3), Irina Lupescu (CO), prezentata la Simpozionul INCDSB si publicata in Romanian Biological Sciences, vol VII, nr. 1-4, pg. 55-60, 2009, ISSN 1584-0158. Partenerul 2, Biotehgen - Elaborarea unui model experimental (partea I - cercetari preliminare) privind obtinerea de culturi celulare vegetale pentru demonstrarea totipotentei biochimice privind inhibitorii cercetati Pornind de la principiile generale ale tehnicilor de cultura in vitro a caror aplicabilitate a fost verificata in cazul majoritatii speciilor, cercetarile efectuate au vizat stabilirea conditiilor optime pentru obtinerea de biomasa calusala la M. Charantia in scopul utilizarii acesteia ca sursa de inhibitori ai serin-proteazelor, prin parcurgerea urmatoarelor etape: 1. obtinerea materialului utilizat ca sursa de explante si asepsizarea de suprafata; 2. alegerea mediului de cultura; 3
3. inocularea si incubarea culturilor in vitro pentru stimularea dezvoltarii de calus. Sursa de explante a constat din plantule obtinute prin germinarea semintelor in conditii aseptice. In acest scop s-a procedat la sterilizarea de suprafata a materialului biologic initial, avand in vedere faptul ca asigurarea asepsiei materialului donor reprezinta un element de baza de care depinde succesul stabilirii culturilor in vitro. S-a stabilit tipul de agent sterilizant, concentratia optima a acestuia si durata de actiune. Formulele nutritive standardizate au fost stabilite pe baza unor testǎri ample ale efectului tipului şi concentrańiei diferitelor ingrediente, în funcńie de procesul morfogenetic care urmeazǎ a fi indus. Ca formula nutritivǎ optimǎ şi pentru inińierea culturilor de calus pe termen lung, s-a ales mediul de culturǎ bazal Murashige si Skoog, testându-se, in cadrul a 4 variante de lucru, efectul unor suplimente hormonale constand din diferite concentratii si combinatii de auxine si citochinine Fitohormonii administrati in mediul de cultura in diferite variante privind concentratiile si combinatiile au stimulat dezvoltarea de calus organogen, care poate fi mentinut in cultura pe termen lung; variantele de mediu optime pentru dezvoltarea de calus organogen pe termen lung de la toate tipurile de explante au fost V1 si V2, fapt ce demonstreaza efectul stimulativ al auxinelor NAA si IBA asupra calusarii la explantele somatice de M. charantia, in timp ce pe variantele de mediu suplimentate cu auxina 2,4 D cresterea calusului a fost slaba. Cu toate ca s-a realizat calusarea de la toate tipurile de explante, cele mai responsive au fost explantele de cotiledoane si de hipocotil. Rezultatele preliminare ale testarii raspunsului in vitro al explantelor de diferite tipuri prelevate de la plantule obtinute prin germinarea semintelor de Momordica charantia in conditii aseptice, au evidentiat in cazul culturilor initiate conform prezentului model experimental, efectul stimulativ al conditiilor de cultura in vitro asupra dezvoltarii de calus organogen (rizogenetic) de la toate tipurile de explante somatice prelevate de la plantule de M. charantia. Cercetarile preliminare intreprinse privind obtinerea de culturi celulare de la explante somatice de M. charantia constituie repere pentru optimizarea metodei in ce priveste randamentul si reproductibilitatea. Culturile celulare vegetale obtinute in urma modelului experimental aplicat au fost preluate de catre partenerul 1 (ICCF) pentru a fi prelucrate in vederea extractiei si purificarii inhibitorilor de serin-proteaze prezenti. Rezultatele obtinute au fost comunicate in lucrarea Studies on Serine Protease Inhibitor Production by Using In Vitro Cultures of Momordica Charantia, autori: Ana Rosu 4
(P2), Mihaela Carmen Eremia (P1), Irina Lupescu (CO), Stefana Jurcoane (P2), LuminiŃa Tcacenco (P3), Silvana Guidea (P2), prezentata la conferinta internationala The 4th Global Summit on Medicinal & Aromatic Plants - 2009, Kuching, Sarawak, Malaysia. Partenerul 4, Hofigal S.A. - Experimentare la nivel laborator a diferitelor metode de extractie a inhibitorilor de serin protease din diferite surse vegetale. Lucrarile experimentale efectuate in cadrul acestei etape se refera la identificarea si selectarea celor mai eficiente metode de extractie primara a inhibitorilor de serin-proteaze din diferite surse vegetale. Sursele de inhibitori de serin proteaza au fost obtinute in urma cultivarii plantelor alese pentru studiu in serele HOFIGAL, in unele cazuri utilizandu-se si produse secundare (srot) rezultate in urma prelucrarii materialului vegetal in alte scopuri (obtinerea uleiului de in). Sursele de inhibitori de serin proteaza studiate au fost: ovaz (planta pulbere), orz (planta pulbere), seminte in (mojarate si macinate), seminte Momordica (mojarate), srot de in. Materiile prime vegetale utilizate au fost caracterizate din punct de vedere al prezentei compusilor biologic activi de interes, enzime si inhibitori enzimatici, evidentiindu-se prezenta inhibitorilor de serin-proteaze. Pentru extracńia primara a proteinei cu activitate inhibitoare din materialul vegetal s-au parcurs urmatoarele etape: - delipidizarea materialului vegetal, prin tratare cu acetona; - solubilizarea proteinelor vegetale, utilizand 2 variante de mediu de extractie: tampon acetat 0,1M ph 5,0 si ser fiziologic (Na Cl 0,9 %). - indepărtarea compuşilor poliglucidici (se impune datorită conńinutului mare în polizaharide al seminńelor), prin tratarea extractelor din faza anterioara cu un volum egal de alcool etilic, la temperatura de 4 0 C, sub agitare, urmata de separarea precipatului polizaharidic mucilaginos, prin centrifugare; - precipitarea fractionata a proteinelor cu activitate inhibitoare serin-proteazică, prin tratarea supernatantului rezultat in etapa anterioara cu 4 volume etanol fańă de volumul supernatantului, sub agitare, la o temperatură de +4 0 C. Precipitatele obtinute dupa uscare sub vid, se prezinta sub forma unor pulberi fine, dintre acestea evidentiindu-se ca activitate inhibitoare asupra serin-proteazelor preparatul obtinut din seminte de in si de Momordica. Celelalte materiale vegetale folosite orz, ovaz s-au dovedit mult inferioare din acest punct de vedere. 5
Pentru faza urmatoare se are in vedere continuarea cercetarilor si in directia folosirii materialului vegetal in forma concentrata in proteine si anume: folosirea turtelor de seminte care rezulta dupa presare la rece si indepartarea uleiului, avand in vedere faptul ca unele din semintele cercetate au pana la 30% ulei prin indepartarea caruia partea proteica se concentreaza. Partenerul 1, INCDCF-ICCF - Experimentarea la nivel de laborator a diferitelor metode de extractie si purificare partiala a inhibitorilor de serin-proteaza Cercetarile efectuate in aceasta etapa au avut urmatoarele obiective principale: a) elaborarea unor metode experimentale de laborator privind extractia si purificarea partiala a inhibitorilor de serin-proteaze obtinuti din doua tipuri de materii prime vegetale: seminte si culturi celulare (obtinute de partenerul 2, Biotehgen), apartinand speciilor: Momordica charantia, (castravete amar) Linum usitatissimum (in) si Citrullus vulgaris (pepene verde). b) utilizarea suportului afin obtinut de partenerul 3 (INCDSB) pentru purificarea prin cromatografie de afinitate a inhibitorilor de serin-proteaze. Studiile experimentale privind extracńia şi purificarea parńială a proteinei vegetale cu activitate inhibitoare serin-proteazică s-au efectuat după următorul protocol şi anume: delipidizarea materialului vegetal, uscarea pulberii obńinute, extracńia apoasă, extracńia fracńionată cu alcool etilic prin precipitarea proteinelor vegetale, uscarea precipitatului, purificarea parńială prin cromatografie Studiile efectuate s-au diferenńiat după cum urmează: 1. după materia primă utilizată, ca specie vegetală şi mod de prezentare, pulbere şi/sau culturi celulare - la specia Momordica charantia L, s-au utilizat în studiu atât seminńe măcinate cât şi culturi celulare - la specia Linum usitatissimum, s-au utilizat în studiu atât seminńe măcinate cât şi culturi celulare - la specia Citrullus vulgaris, s-au utilizat în studiu doar seminńe măcinate 2. după metoda de purificare aborbată pe specie vegetală - la specia Momordica charantia L, extractul apos din seminńele măcinate delipidizate s-a precipitat cu alcool etilic şi s-a purificat prin cromatografie de afinite pe tripsină imobilizată - la specia Momordica charantia L, culturile celulare din seminńe s-au supus delipidizării şi extracńiei apoase, urmată de precipitarea cu alcool etilic. 6
- la specia Linum usitatissimum, extractul apos din seminńele măcinate delipidizate s-a precipitat cu alcool etilic şi s-a purificat prin cromatografie de schimb ionic, urmată de cromatografie de afinite pe tripsină imobilizată - la specia Linum usitatissimum, culturile celulare din seminńe s-au supus delipidizării şi extracńiei apoase, urmată de precipitarea cu alcool etilic şi purificare prin cromatografie de schimb ionic. - la specia Linum usitatissimum, culturile celulare din seminńe s-au supus delipidizării şi extracńiei apoase, urmată de precipitarea cu alcool etilic şi purificare prin cromatografie de afinite pe tripsină imobilizată. - la specia Citrullus vulgaris, s-au utilizat în studiu seminńe măcinate, delipidizate, supuse extracńiei apoase, urmată de precipitarea cu alcool etilic şi purificare prin cromatografie de afinite pe tripsină imobilizată. După cum rezulta din datele prezentatesintetic in tabelulurmator, materialul prelucrat din culturile celulare ale seminńelor plantelor studiate este îmbogăńit în proteină potentă din punct de vedere al activităńii inhibitoare serin-proteazică, şi anume: in cazul probelor de in (Linum usitatissimum), la 100g pulbere delipidizată se obńine prin extracńie alcoolică o cantitate de precipitat de cca 2 ori mai mare în cazul utilizării culturilor celulare fańă de seminńele ca atare. In cazul probelor de Momordica charantia, la 100g pulbere delipidizată se obńine prin extracńie alcoolică o cantitate de precipitat de aproximativ 5 ori mai mare în cazul utilizării culturilor celulare fańă de seminńele ca atare. În ceea ce priveşte purificarea extractelor proteice alcoolice obńinute din seminńele de in, pepene verde şi Momordica charantia se observă că în cazul unui precipitat cu activitate specifică mică, cuprinsă între 200-1000UI/mg proteină este necesară purificarea prin cele două metode de cromatografie: de schimb ioni şi de afinitate, într-un flux continuu; în cazul pulberilor având o activitate specifică mai mare, cuprinsă între 1500-10000UI/mg proteină se poate purifica fie prin cromatografie de schimb ioni, fie prin cromatografie de afinitate, pentru creşterea potenńei biochimice a inhibitorilor cercetańi. CO, USAMV Experimentarea unor metode de hidroliza partiala controlata a inhibitorilor purificati si caracterizarea compusilor obtinuti Pe langa studii documentare, cercetarile efectuate in aceasta etapa au vizat stabilirea conditiilor de realizare a unei proteolize enzimatice partiale a inhibitorilor polipeptidici cercetati, pentru a obtine o peptida cu masa moleculara cuprinsa intre 3000-7000Da, utilizand ca substrat inhibitorul de serin-proteaze din seminte de soia, izolat si purificat prin metodele aplicate de 7
partenerul INCDCF-ICCF. In acest scop, s-au utilizat ca biocatalizatori doua preparate enzimatice comerciale cu activitate proteolitica si anume termolizina si catepsina B. S-a urmarit evolutia gradului de hidroliza (calculat conform metodei lui Adler-Nissen, ca procent de legaturi peptidice clivate raportat la numarul total de legaturi peptidice din substratul initial) a substratului polipeptidic in timp, in urmatoarele conditii de lucru: - concentratie inhibitor de serin-proteaze din soia: 1% g/v - raportul enzima/substrat (E/S): 5% g/g - ph de reactie (mentinut prin corectie cu solutie de NaOH 1N) = 8, in cazul hidrolizei cu termolizina si 8,5 in cazul hidrolizei cu catepsina B. - temperatura de reactie: 37 0 C si 55 0 C - timp de reactie: 24 ore - agitare: 180 rpm Experientele efectuate au condus la urmatoarele rezultate: - temperatura de 55 0 C favorizeaza hidroliza enzimatica a substratului polipeptidic in cazul ambelor enzime utilizate ca biocatalizatori; - atingerea unui grad de hidroliza enzimatica de pana la 22,4% si 25,6%, in cazul utilizarii termolizinei la 37 0 C si respectiv 55 0 C. - atingerea unui grad de hidroliza enzimatica de pana la 21,4% si respectiv 22,6%, in cazul utilizarii catepsinei B, la cele doua temperaturi mentionate - cresterea semnificativa a gradului de hidroliza in primele 6 ore, dupa care viteza de reactie se micsoreaza considerabil; - proteazele folosite pot asigura, in conditiile sus-mentionate, proteoliza inhibitorului de serinproteaze din soia, pana la fragmente peptidice cu mase moleculare mai mici de 10.000Da. Hidrolizatele proteice obtinute au fost caracterizate prin electroforeza SDS-PAGE. In etapele ulterioare de cercetare urmeaza a se izola aceste fragmente peptidice cu mase moleculare mici, in vederea testarii capacitatii lor de inhibare a serin-proteazelor. La activitatile de cercetare efectuate de catre CO si P1 in cadrul proiectului a participat un student din anul V al Facultatii de Biotehnologii din cadrul USAMV Bucuresti, contributia acestuia fiind concretizata in proiectul de diploma intitulat Studii privind inhibitorii de serinproteaze şi aplicańiile lor biomedicale, sustinut in iunie 2009, la finalizarea studiilor de licenta, de catre absolventa Pintilie Mirela si elaborat sub conducerea d-nei dr. chim. Irina Lupescu si sub indrumarea d-nei drd. MIHAELA EREMIA. 8