REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Sinteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali Doctorand Denisa Hapău Conducători de doctorat Pr

REZUMATUL TEZEI DE DCTRAT inteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali Doctorand Denisa Hapău Conducători de doctorat Prof.dr. Valentin Zaharia Prof.dr. ing. Florin Dan Irimie, Universitatea "Babeş-Bolyai" Cluj-apoca

2 Hapău Denisa CUPRI ITRDUCERE 11 TADIUL ACTUAL AL CUAŞTERII 1. Compuşi cu structură tiazolică 15 1.1. Metode de obţinere a compuşilor tiazolici 15 1.2. Comportarea chimică şi biologică a compuşilor tiazolici 16 2. inteza stereoselectivă. Biocataliza 19 2.1. Rezoluţia cinetică. Rezoluţia cinetică dinamică 20 2.2. Reacţii enzimatice catalizate de lipaze 21 3. Metode de sinteză a alcoolilor secundari optic activi 25 3.3.1. Bioreducerea asimetrică a cetonelor prochirale 25 3.3.2. Hidroxilarea asimetrică 27 3.3.3. Condensarea aldolică asimetrică 29 3.3.4. Rezoluţia cinetică enzimatică 30 4. Metode de sinteză a -aminoacizilor optic activi 31 4.4.1. Aminarea reductivă a -cetoacizilor 31 4.4.2. Transformări stereoselective catalizate de amoniac liaze 33 4.4.3. Transaminarea catalizată de aminotransferaze 34 4.4.4. Rezoluţia cinetică enzimatică a -aminoacizilor şi a derivaţilor lor 35 5. Concluzii 37 CTRIBUŢIA PERALĂ 1. Ipoteza de lucru/obiective 41 2. Metodologie generală 43 3. inteza unor 1-(2-ariltiazol-4-il)etanoli optic activi prin rezoluţie cinetică enzimatică 47 3.1. Introducere 47 3.2. Ipoteza de lucru 47 3.3. Material şi metodă 48 3.4. Rezultate şi discuţii 49 3.4.1. inteza substraturilor pentru reacţiile enzimatice 49 3.4.2. Acilarea enzimatică la scară analitică a 1-(2-ariltiazol-4-il)etanolilor rac-3a-d 51 3.4.3. Alcooliza enzimatică la scară analitică a rac-4a-d 52 3.4.4. inteza enzimatică la scară preparativă 53 3.4.5. Determinarea configuraţiei absolute a produşilor tiazolici optic activi 57 3.5. Concluzii 59 3.6. Partea experimentală 59 4. inteza unor 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanoli optic activi prin rezoluţie cinetică enzimatică 4.1. Introducere 65 4.2. Ipoteza de lucru 66 4.3. Material şi metodă 66 4.4. Rezultate şi discuţii 67 4.4.1. inteza tiazol-5-il etanolilor racemici 67 4.4.2. Acilarea enzimatică la scară analitică a rac-6a-d 68 4.4.3. Alcooliza enzimatică la scară analitică a rac-7a-d 69 4.4.4. inteza enzimatică la scară preparativă 70 4.4.5. Determinarea configuraţiei absolute a produşilor obţinuţi prin rezoluţie cinetică 73 65

1. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali 3 enzimatică 4.5. Concluzii 74 4.6. Partea experimentală 75 5. inteza chemoenzimatică a unor L- -aminoacizi cu structură tiazolică 5.1. Introducere 81 5.2. Ipoteza de lucru 82 5.3. Material şi metodă 84 5.4. Rezultate şi discuţii 84 5.4.1. inteza precursorilor pentru reacţiile enzimatice 84 5.4.2. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a L- -aminoacizilor 85 5.5. Concluzii 93 5.6. Partea experimentală 94 6. Discuţii generale 101 7. Concluzii generale 105 8. riginalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei 107 REFERIŢE 109 Cuvinte cheie: tiazol, rezoluţie cinetică, biocataliză, alcooli secundari, -aminoacizi Introducere Reacţiile stereoselective ocupă un domeniu vast, atât prin implicaţiile pe care stereoselectivitatea le are în transformările din organismele vii, cât şi prin potenţialele aplicaţii pentru sinteza stereocontrolată a unor noi compuşi cu utilizări în domeniul industrial şi farmaceutic. Compuşii organici funcţionali chirali reprezintă substanţe cheie care pot fi valorificate ca atare sau integrate în structuri mai complexe, în scopul obţinerii unor noi agenţi terapeutici cu efecte noi sau îmbunătăţite, determinate de prezenţa centrului stereogenic. Cerinţa tot mai mare de intermediari chirali în forma enantiopură a condus la o dezvoltare semnificativă a sintezei stereoselective. În ultima decadă au fost raportate în literatura de specialitate noi metode de sinteză stereoselectivă, foarte diferite din punctul de vedere al mecanismului, al intermediarilor, al condiţiilor de reacţie şi al claselor de compuşi pentru care se aplică. e constată noi direcţii de abordare a sintezelor stereocontrolate: una dintre ele convenţională, în care reacţia este asistată de un chemocatalizator chiral şi alta modernă, extrem de dinamică, axată pe utilizarea biocatalizatorilor, compuşi naturali chirali. Deoarece dezvoltarea unui proces la scară industrială ridică probleme economice şi legate de afectarea mediului înconjurător, în prezent există tendinţa de a limita pe cât posibil implementarea acelor procese care produc deşeuri dăunătoare mediului şi de a simplifica procesele tehnologice, prin utilizarea unor condiţii de reacţie cât mai blânde. În acest sens, metodele biocatalitice reprezintă o alternativă avantajoasă şi ecologică a proceselor chimice convenţionale, deoarece se desfăşoară în condiţii blânde de reacţie, produc deşeuri biodegradabile şi există posibilitatea reciclării biocatalizatorului, în cazul în care se lucrează cu enzime imobilizate care pot fi uşor separate şi reutilizate în mai multe cicluri fără pierderea activităţii. La aceste avantaje se adaugă lipsa toxicităţii precum şi proprietăţile enzimelor, uneori superioare catalizatorilor convenţionali (chemoselectivitate, regioselectivitate şi stereoselectivitate). copul acestei teze de doctorat este punerea la punct a unor procedee chemoenzimatice eficiente pentru obţinerea unor alcooli secundari şi a unor -aminoacizi chirali derivaţi de tiazol, ca potenţiali sintoni chirali în sinteza organică a unor noi structuri cu potenţial biologic.

4 Hapău Denisa Deoarece poziţia și natura substituenţilor pot influenţa semnificativ activitatea și stereoselectivitatea enzimei pentru un anumit substrat, a fost necesară investigarea şi optimizarea separată a reacţiilor enzimatice pentru substraturile în care centrul stereogenic este grefat în poziţia 4 şi respectiv 5 a nucleului tiazolic. Principalele trei obiective ale acestui studiu au fost: 1. inteza chemoenzimatică a unor 1-(2-ariltiazol-4-il)etanoli optic activi. 2. inteza chemoenzimatică a unor 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanoli optic activi. 3. inteza chemoenzimatică a unor L- -aminoacizi cu structură tiazolică. În cadrul fiecărui studiu au fost realizate următoarele etape: inteza precursorilor tiazolici divers funcţionalizaţi inteza substraturilor necesare pentru reacţiile enzimatice tabilirea unor metode analitice de separare a enantiomerilor amestecurilor racemice, prin cromatografie de lichide de înaltă performanţă cu fază staţionară chirală ptimizarea proceselor de rezoluţie cinetică enzimatică aplicate inteza stereoselectivă, la scară preparativă, a compuşilor tiazolici chirali Caracterizarea fizică şi chimică a compuşilor obţinuţi (determinarea configuraţiei absolute, a rotaţiei optice specifice, a excesului enantiomeric şi analiza spectrală 1 H RM, 13 C RM, M). Etapele de sinteză stereoselectivă s-au bazat pe procedee de rezoluţie cinetică enzimatică, clasică sau dinamică, sub acţiunea catalitică a enzimelor din clasa hidrolazelor: lipaze şi aminoacilaze. Reacţiile enzimatice au fost monitorizate prin analiză HPLC sau RP-HPLC cu faze staţionare chirale. Conversia, excesul enantiomeric ee si raportul enantiomeric E au fost calculate pe baza cromatogramelor obţinute. Contribuţia personală tudiul 1. inteza unor 1-(2-ariltiazol-4-il)etanoli optic activi prin rezoluţie cinetică enzimatică Acest studiu îşi propune investigarea rezoluţiei cinetice enzimatice în seria unor alcooli secundari derivaţi de tiazol, în care grupa hidroxietil este grefată în poziţia 4 a nucleului tiazolic. Pentru sinteza amestecurilor racemice de 1-(2-ariltiazol-4-il)etanoli necesari în reacţiile enzimatice, s-au aplicat etapele descrise în chema 1. R H 2 + Cl Cl I. Cl II. -H 2 -HCl R 1 1a-d R 2a-d R = a. H ; b. 3- ; c. 4- ; d. 4-Br R rac-3a-d IV. R rac-4a-d chema 1. inteza 1-(2-ariltiazol-4-il)etanolilor și a esterilor lor. Condiţii de reacţie: I.1) acetonă anhidră, 24 h, 2) H24 conc, 2 h; II. 1). urotropină, CHCl3, reflux, 1.5 h, 2) urotropină, CH3CH 50%, reflux 1 h; 1) CH3MgI, dietileter, reflux; 2) H4Cl sat.; IV. CH2Cl2 anhidru, (CH3C)2, Et3/DMAP ubstratul rac-3a a fost acilat cu diverse enzime, în acetat de vinil. Enzima CaL-B a prezentat activitatea și enantioselectivitatea cea mai bună (E>>200). Lipaza din Mucor miehei şi lipaza produsă de Pseudomonas fluorescens au prezentat, de asemenea, enantioselectivităţi mari în rezoluţia cinetică la conversii de peste 20%. 1 Deoarece natura solventului poate influenţa semnificativ activitatea și stereoselectivitatea lipazei, a fost investigată reacţia de acetilare a rac-3a în prezenţa CaL-B, cu acetat de vinil, în diverși solvenţi. Enantioselectivitatea CaL-B a fost mare în majoritatea cazurilor, dar activitatea 1 Hapău D, Brem J, Moisă M, Toşa MI, Irimie FD, Zaharia V. erocycles 32. Efficient kinetic resolution of 1-(2-arylthiazol-4-yl) ethanols and their acetates using lipase B from Candida antarctica, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 94: 88-94.

1. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali 5 enzimei a fost afectată semnificativ de natura solventului (Tabel 1). Utilizarea toluenului ca solvent a dat rezultatele cele mai bune pentru acetilarea mediată de CaL-B a alcoolului rac-3a. Tabel 1. creeningul de solvenţi pentru acilarea rac-3a cu CaL-B și acetat de vinil, timp de reacţie: 5.5 ore r. crt. olvent c 1 (%) ee ()-3a (%) ee (R)-4a (%) E 1 n-hexan 37.29 59.16 >99.5»200 2 n-ctan 48.80 94.83 >99.5»200 3 Ciclohexan 45.95 84.60 >99.5»200 4 Cloroform 1.66 1.68 >99.5»200 5 Toluen 49.75 98.50 >99.5»200 6 Diizopropileter 37.35 59.31 >99.5»200 7 Tetrahidrofuran 29.39 40.15 96.48 82.78 8 Acetonitril 41.08 69.37 >99.5»200 9 Metil terţ-butil eter 38.92 63.31 99.35»200 Metoda astfel optimizată a fost aplicată și pentru rezoluţia cinetică a alcoolilor rac-3b-d, obţinându-se rezultate la fel de bune (ee>99.5%, c = 50% după 6-9 ore). Lipazele prezintă aceeași enantiopreferinţă atât în procesul de acilare cât și în procesul de alcooliză. De aceea, prin rezoluţie cinetică mediată de lipaze se pot obţine atât enantiomerii ai alcoolilor tiazolici prin acilare enantioselectivă, cât și enantiomerii cu configuraţie R, prin procesul invers, de alcooliză enantioselectivă a esterilor respectivi. Pentru obţinerea enantiomerilor (R)-3a-d și ()-4a-d, s-a investigat alcooliza enzimatică a esterilor rac-4a-d, catalizată de CaL-B, în diverși solvenţi și în prezenţă de metanol ca nucleofil. Cea mai mare stereoselectivitate s-a obţinut în metil terţ-butil eter ca solvent (E>200). Atât la alcooliză cât și la acilare s-a observat o activitate enzimatică mai scăzută pentru transformarea substratului derivat de p-bromofeniltiazol. Condiţiile de reacţie optimizate au fost aplicate pentru sinteza la scară preparativă a 1-(2- ariltiazol-4-il)etanolilor şi a esterilor lor acetici, în ambele forme enantiomere (chema 2). + II. rac-3a-d (R)-4a-d ()-3a-d I. + rac-4a-d (R)-3a-d ()-4a-d chema 2. inteza chemoenzimatică a (R)- și ()-1-(2-ariltiazol-4-il)etanolilor 3a-d și a esterilor lor. Condiţii de reacţie: I. (CH3C)2, DMAP/Et3/CH2Cl2; II. CaL-B, acetat de vinil, toluen; CaL-B, MeH/MTBE. Tabel 2. Randamentele, excesele enantiomerice și rotaţiile specifice pentru produșii rezoluţiei cinetice enzimatice (R)- și ()-3,4a-d r. crt. Produs % ee (%) [ ] D 1 Produs (%) ee (%) [ ] D 3 1 ()-3a 48 >99.5-8.60 (R)-3a 48 98 +8.1 2 ()-3b 48 98.5-7.00 (R)-3b 47 >99.5 +7.2 3 ()-3c 49 >99.5-6.80 (R)-3c 48 >99.5 +7.0 4 ()-3d 48 >99.5-10.25 (R)-3d 48 98 +9.8 5 (R)-4a 48 99 +126.4 ()-4a 49 99-126.0 6 (R)-4b 47 >99.5 +119 ()-4b 47 98-117.5 7 (R)-4c 48 99 +112.8 ()-4c 46 98-111.3 8 (R)-4d 47 99.3 +97 ()-4d 49 90-88.3 1c 1.0, CHCl3, 25ºC Br a. b. c. d.

6 Hapău Denisa Cromatogramele pentru rezoluţia cinetică a rac-3,4a sunt prezentate în Fig. 1-3. 1 Fig.1. epararea HPLC a enantiomerilor rac-3,4a pe coloană Chiralpak IB, eluent n-hexan: 2-propanol = 99:1 80:20 (v/v). Procedura de separare în gradient: 0-9 min: 1% iprh; 9.1-16 min.: 20% iprh. Fig.2. Rezoluţia cinetică mediată de CaL-B pentru rac-3a cu acetat de vinil, în toluen Fig.3. Metanoliza catalizată de CaL-B a rac-4a în MTBE Concluzii A fost elaborată o metodă chemoenzimatică stereoselectivă de obţinere a unor noi 1-(2- ariltiazol-4-il)etanoli și a esterilor lor cu acidul acetic, în ambele forme enatiomere. Pentru procesul de acilare enzimatică enantioselectivă, cele mai bune rezultate s-au obţinut cu enzima CaL-B (5 mg/ml) şi cu acetatul de vinil (4 echiv) în toluen. CaL-B a fost biocatalizatorul optim și pentru metanoliza esterilor acetici corespunzători rac-4a-d, în terţ-butil metil eter ca solvent. Compușii ()-3a-d împreună cu esterii (R)-4a-d s-au obţinut cu enantiopurităţi şi cu randamente mari (ee>98.5%) prin rezoluţia cinetică mediată de CaL-B a alcoolilor corespunzători racemici. Formele enantiomeric opuse (R)-3a-d împreună cu esterii ()-4a-d s- au obţinut prin metanoliza enantioselectivă catalizată de CaL-B a esterilor rac-4a-d. 1 Hapău D, Brem J, Moisă M, Toşa MI, Irimie FD, Zaharia V. erocycles 32. Efficient kinetic resolution of 1-(2-arylthiazol-4-yl) ethanols and their acetates using lipase B from Candida antarctica, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 94: 88-94.

1. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali 7 tudiul 2. inteza unor 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanoli optic activi prin rezoluţie cinetică enzimatică biectivul acestui studiu este elaborarea unui proces chemoenzimatic stereoselectiv bazat pe rezoluţia cinetică a unor alcooli secundari chirali derivaţi de tiazol, în care grupa hidroxietil este grefată în poziţia 5 a nucleului tiazolic. Alcoolii secundari derivaţi de tiazol rac-6a-d şi esterii corespunzători necesari în reacţiile enzimatice au fost sintetizaţi conform etapelor descrise în chema 3. H 2 + R 1 Cl CH I. 3 II. -H 2 -HCl R 1 5a-d R 1 = a. H ; b. 3- ; c. 4- ; d. 4-Br CH3 R 1 rac-6a-d R 1 R 2 = n-pr (rac-7a-d); Et (rac-7'a-d); Me (rac-7''a-d) rac-7a-d chema 3. inteza 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanolilor și a esterilor lor. Condiţii de reacţie: I.1). acetonă anhidră, 24h, 2). H24 conc., 2h; II. abh4, metanol; (RC)2, Et3/DMAP, diclorometan anhidru. Alcoolul racemic rac-6a a fost folosit ca substrat model pentru optimizarea rezoluţiei cinetice enzimatice. Mai întâi, s-a testat acilarea rac-6a cu acetat de vinil, în prezenţa a diverse enzime: lipaza B din Candida antarctica (CaL-B), lipaza A din Candida antarctica (CaL-A), lipaza din Rhyzopus oryzae, lipaza din pancreasul de porc, lipaza din Pseudomonas fluorescens, lipaza din Candida rugosa, lipaza din Mucor miehei, lipaza din Burkholderia cepacia. CaL-B a prezentat stereoselectivitatea maximă, de aceea a fost aleasă ca biocatalizator în experienţele următoare. electivitatea enzimei CaL-B pentru transformarea substratului rac-6a a fost evaluată în prezenţa a diverși solvenţi și diverși agenţi de acilare. Cele mai bune enantiopurităţi s-au obţinut în ciclohexan (Tabel 3) şi cu butanoat de vinil ca agent de acilare (Tabel 4). 1 Tabel 3. creeningul de solvenţi pentru acetilarea rac-6a catalizată de CaL-B, cu acetat de vinil, timp de reacţie 36 ore r. crt. olvent c(%) ee ()-6a (%) ee (R)-7a (%) E 1 n-hexan 53 97 87 58 2 n-ctan 53 97 86 54 3 Ciclohexan 52 98 92 102 4 Cloroform 24 30 97 81 5 Toluen 50 94 93 92 6 Diizopropil eter 45 78 94 83 7 Tetrahidrofuran 26 97 34 87 8 Acetonitril 39 96 61 87 9 Metil terţ-butil eter 49 88 93 77 Tabel 4. Rezoluţia cinetică mediată de CaL-B pentru rac-6a-d cu diverși agenţi de acilare, în ciclohexan ca solvent Timp c ee (R)-7a-d ee ()-6a-d r. crt. Agent de acilare ubstrat (ore) (%) (%) (%) 1 Acetat de vinil rac-6a 36 52 92 98 110 2 Propanoat de vinil rac-6a 65 50 96 94 174 3 Butanoat de vinil rac-6a 65 50 98 98»200 4 Butanoat de vinil rac-6b 45 50 97 97»200 5 Butanoat de vinil rac-6c 19 49 >99.5 97»200 6 Butanoat de vinil rac-6d 69 50 98 >99.5»200 Pentru alcooliza esterilor rac-7a-d, s-au testat diverse lipaze în diverși solvenţi și în prezenţa a diverși nucleofili (metanol, etanol, propanol, butanol), dar în majoritatea cazurilor enzimele nu au fost active. Doar CaL-A s-a dovedit a fi eficientă pentru rezoluţia cinetică a esterilor rac-7a-d. Cele mai bune rezultate s-au obţinut utilizând enzima CaL-A CLEA (lipaza A E R 2 1 Hapău D, Brem J, Zaharia V. erocycles 30: Lipase catalyzed kinetic resolution of racemic 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5- yl)ethanols, Tetrahedron Asymmetry 2011, 22(24): 2165-2171.

8 Hapău Denisa din Candida antarctica reticulată cu aldehidă glutarică), în eter diizopropilic ca solvent și în prezenţa metanolului ca nucleofil (ee>99.5%, E>200). Aplicând condiţiile de reacţie optime, stabilite la scara analitică, s-a realizat sinteza chemoenzimatică la scară preparativă a 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanolilor şi a esterilor lor butanoici, în ambele forme enantiomere (chema 4). II. rac-6a-d (R)-7a-d ()-6a-d I. + c. + d. Br rac-7a-d (R)-6a-d ()-7a-d chema 4. Rezoluţia cinetică enzimatică în seria 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanolilor. Condiţii de reacţie: I. (CH3CH2CH2C)2, Et3/DMAP, CH2Cl2; II. CaL-B, butanoat de vinil, ciclohexan; CaL-A, MeH/DIPE. Tabel 5. Randamentele, excesele enantiomerice și rotaţiile optice pentru compușii ()- și (R)-6,7a-d r. crt. Produs 1 % ee (%) [ ] 3 D Produs 2 (%) ee (%) [ ] 3 D 1 ()-6a 45 98.5-53.4 (R)-6a 41 >99.5 +52.8 2 ()-6b 45 98.5-56.0 (R)-6b 40 >99.5 +56.8 3 ()-6c 46 92.0-54.0 (R)-6c 42 >99.5 +57.6 4 ()-6d 44 91.5-40.0 (R)-6d 39 >99.5 +44.5 5 (R)-7a 44 98.0 +152 ()-7a 45 98.6-152.4 6 (R)-7b 44 97.0 +144 ()-7b 44 98.2-144.8 7 (R)-7c 45 >99.5 +167.6 ()-7c 46 >99.5-167.5 8 (R)-7d 43 96.2 +99.2 ()-7d 44 97.3-99.4 1 c 1.0, CHCl 3, 25 C Concluzii serie de noi 1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanoli optic activi au fost obţinuţi în ambele forme enantiomere, prin procese de rezoluţie cinetică mediate de enzimele CaL-B și CaL-A. Acilarea enzimatică enantioselectivă s-a realizat sub acţiunea catalitică a enzimei CaL-B, cu butanoat de vinil ca agent de acilare și în ciclohexan ca solvent, prin această metodă obţinându-se ()-1-(2-aril-4-metil-tiazol-5-il)etanolii cu excese enantiomerice de 91.5-98.5%. Alcoolii tiazolici cu configuraţie R s-au obţinut printr-o reacţie de metanoliză enzimatică a esterilor butanoici corespunzători, sub acţiunea enzimei CaL-A, în eter diizopropilic ca solvent. tudiul 3. inteza chemoenzimatică a unor L- -aminoacizi cu structură tiazolică În acest studiu, s-a urmărit elaborarea unei metode chemoenzimatice bazate pe procese de rezoluţie cinetică, clasică şi dinamică, pentru obţinerea unor L- -2-ariltiazol-4-il alanine, pornind de la aminoacizii racemici -acetilaţi corespunzători. Etapa cheie în sinteza stereoselectivă este rezoluţia cinetică dinamică a oxazol-5(4h)- onelor tiazolice, printr-o reacţie de deschidere de ciclu enantioselectivă, utilizând alcooli alifatici ca nucleofili, sub acţiunea catalitică a lipazelor (chema 5). Principalele cerinţe pentru ca această metodă să fie eficientă sunt: capacitatea lipazei de a accepta şi de a transforma în mod stereoselectiv substratul respectiv, capacitatea substratului netransformat de a se racemiza cu o viteză suficient de mare, precum şi proprietatea oxazolonei-substrat de a rezista la atacul alcoolului nucleofil fără participarea enzimei. a. b.

1. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali 9 + R H lipaza rapid R HC H 2 CH k invr- k inv-r + R H lipaza lent R HC = chema 5. Rezoluţia cinetică dinamică a oxazol-5(4h)-onelor tiazolice altă metodă enzimatică aplicată în acest studiu constă în hidroliza L-enantioselectivă a -acetil- -aminoacizilor tiazolici la nivelul grupei amidă, sub acţiunea catalitică a aminoacilazei (chema 6). CH HC aminoacilaza + H 2 ph 8-9 - CH3 CH CH + H 2 chema 6. Hidroliza enzimatică enantioselectivă a -acetil- -aminoacizilor tiazolici CH HC Pentru sinteza aminoacizilor tiazolici rac-12a-d şi a derivaţilor lor necesari în procesul de rezoluţie cinetică enzimatică, s-au aplicat etapele descrise în chema 7. I. EtC CEt II. Cl CH HC HC 1a-d 8a-d rac-9a-d IV. V. CR HC rac-10a-d rac-11a-d CH H 2 rac-12a-d chema 7. inteza 2-ariltiazol-4-il alaninelor racemice şi a derivaţilor lor. Reactanţi şi condiţii de reacţie: I. ah, CH3CHCH(CEt)2/DMF, 60:C; II. a). KH 10%, reflux 4h; b). toluen, reflux 2h; Alcool (MeH,EtH,n-PrH, n-buh), carbonildiimidazol/thf; IV. DCC/CH2Cl2; V. HCl 18%, reflux 4h. Prima etapă enzimatică stereoselectivă a fost rezoluţia cinetică dinamică a oxazolonelor rac-11a-d, sub acţiunea catalitică a lipazelor, cu participarea alcoolilor în reacţia de deschidere de ciclu. Produşii de reacţie, -acetilaminoesterii L-10a-d, au fost hidrolizaţi la nivelul grupei ester, în condiţiii slab bazice. Acizii L-2-acetamido-3-(2-ariltiazol-4-il)propanoici rezultaţi, L-9ad, au fost hidrolizaţi enzimatic enantioselectiv la nivelul grupei amidă, sub acţiunea catalitică a Acilazei I. (chema 8). B rac-11a-d I. CR HC II. CH HC CH H 2 L-10a-d L-9a-d (ee 72-80%) L-12a-d (ee>99%) = a R = Et / n-pr chema 8. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a L-(2-ariltiazol-4-il)alaninelor şi derivaţilor lor. Reactanţi şi condiţii: I. CaL-B, etanol (pentru RCD a rac-11a-c) / n-propanol (pentru RCD a rac-11d), acetonitril; II. a2c3/h2, reflux; Acilaza I, ph 8. b c Cl d

10 Hapău Denisa Au fost investigate diverse condiţii de reacţie (enzimă, nucleofil, solvent, catalizator de racemizare) pentru reacţia de deschidere de ciclu a oxazol-5(4h)-onelor rac-11a-d. În cazul transformării substraturilor rac-11a-c, cele mai bune enantiopurităţi s-au obţinut atunci când acetonitrilul a fost utilizat ca solvent şi etanolul ca nucleofil (Tabel 6, linia 4), sub acţiunea catalitică a lipazei B din Candida antarctica şi în prezenţa unui catalizator de racemizare,,-dietilaminoetanol imobilizat pe nanotuburi de carbon. Pentru transformarea substratului rac-11d, la utilizarea n-propanolului s-a observat enantioselectivitatea cea mai bună, în acetonitril (76% ee). Tabel 6. creeningul de solvenţi pentru alooliza enantioselectivă a oxazolonei rac-11a, cu CaL-B şi etanol, în prezenţa catalizatorului de racemizare (dietilaminoetanol imobilizat pe nanotuburi de carbon) r. crt. olvent ee p % 1. 1,4-Dioxan 60.4 2. Diclorometan 1-3. Toluen 60.6 4. Acetonitril, 80.0 5. Tetrahidrofuran 64.0 1 6. Dietileter 30.4 1conversie mică Rezoluţia cinetică enzimatică la scară preparativă a oxazolonelor rac-11b-d s-a realizat în condiţiile de reacţie optime, obţinându-se pe această cale esterii L-2-acetamido-3-(2-ariltiazol- 4-il)propanoici L-11a-d cu randamente de 77-81% şi cu 72-76% ee. Produşii rezoluţiei cinetice dinamice L-10a-d au fost hidrolizaţi la nivelul grupei ester în condiţii de reacţie slab bazice. Pentru a creşte excesul enantiomeric şi pentru a obţine produşii finali în forma enantiopură, următoarea etapă a fost hidroliza enzimatică enantioselectivă la nivelul grupei amidă a -acetil aminoacizilor L-9a-d, sub acţiunea catalitică a Acilazei I, în mediu apos. Pe această cale, s-au obţinut aminoacizii tiazolici L-12a-d cu excese enantiomerice de peste 99%, cu randamente globale cuprinse între 55 şi 58%. Concluzii A fost optimizată o metodă chemoenzimatică pentru obţinerea unei serii de L-(2- ariltiazol-4-il)alanine în forma enantiopură, pornind de la -acetil aminoacizii corespunzători. Primul selector chiral a fost lipaza B din Candida antarctica, într-un proces de rezoluţie cinetică dinamică, bazat pe reacţia de deschidere de ciclu stereoselectivă a oxazol-5(4h)onelor tiazolice în mediu organic, proces prin care s-au obţinut L-aminoacizii -acetilaţi şi esterificaţi (ee = 72-76%), cu randamente de 77-81%. Produşii de rezoluţie cinetică dinamică au fost supuşi hidrolizei chimice la grupa ester în condiţii slab bazice, urmată de hidroliza enantioselectivă a grupei amidă, catalizată de Acilaza I, în mediu apos. Datorită L-specificităţii de substrat a Acilazei I, excesul enantiomeric al produşilor finali a fost crescut la peste 99%. Concluzii generale 1. Au fost sintetizaţi o serie de 1-(2-ariltiazol-4-il)etanoli racemici, prin reacţia de adiţie a iodurii de metilmagneziu la 2-ariltiazol-4-carbaldehidele corespunzătoare. Au fost elaborate două procedee enzimatice stereoselective de separare a 1-(2-ariltiazol-4- il)etanolilor racemici şi a derivaţilor lor -acetilaţi, procedee bazate pe rezoluţia cinetică enzimatică. -au stabilit condiţiile de reacţie optime (enzimă, solvent, agent de acilare, nucleofil) pentru transformarea substraturilor. Rezultatele cele mai bune s-au obţinut cu lipaza B din Candida antarctica, atât în procesul de acilare enantioselectivă a tiazol-4-il etanolilor racemici, cu acetat de vinil în toluen, cât şi în metanoliza esterilor acetici corespunzători, în metil-terţ-butil eter. Prin aceste metode s-au obţinut alcoolii secundari chirali şi esterii lor acetici, în ambele forme enantiomere, cu randamente şi cu enantiopurităţi mari.

1. inteza chemoenzimatică stereoselectivă a unor compuşi tiazolici chirali 11 2. Au fost sintetizaţi o serie de 1-(2-aril-4-metiltiazol-5-il)etanoli racemici, prin reducerea cu borohidrură de sodiu a unor 2-aril-4-metil-tiazol-5-il-etanone. Au fost elaborate două procedee de rezoluţie cinetică enzimatică pentru obţinerea derivaţilor de 2-feniltiazol-5-il etanol şi a esterilor butanoici corespunzători, în ambele forme enantiomere. -au stabilit condiţiile de reacţie optime (enzimă, solvent, agent de acilare, nucleofil) pentru transformarea substraturilor cu enantioselectivitate mare. Alcoolii tiazolici cu configuraţie s-au obţinut prin acilarea enantioselectivă a amestecurilor racemice respective, cu butanoat de vinil, sub acţiunea enzimei CaL-B, în ciclohexan. Alcoolii tiazolici cu configuraţie R s-au obţinut prin metanoliza esterilor butanoici corespunzători, sub acţiunea catalitică a enzimei CaL-A CLEA, în diizopropileter. 3. Au fost sintetizaţi o serie de -aminoacizi derivaţi de 2-feniltiazol şi -acetilderivaţii lor, pornind de la esterul acetamidomalonic şi diverşi 2-aril-4-clorometiltiazoli. -acetil- -aminoacizii tiazolici au fost ciclizaţi la oxazol-5(4h)-onele corespunzătoare. A fost elaborat un procedeu chemoenzimatic pentru sinteza L- -2-ariltiazol-4-il alaninelor în forma enantiopură, prin aplicarea a două etape enzimatice stereoselective. Prima etapă stereoselectivă a fost rezoluţia cinetică dinamică enzimatică, bazată pe reacţia de deschidere de ciclu enantioselectivă a oxazol-5(4h)onelor tiazolice. Cele mai bune enantioselectivităţi s-au obţinut cu etanol sau n-propanol, sub acţiunea lipazei B din Candida antarctica, în acetonitril şi în prezenţa unui catalizator bazic de racemizare, imobilizat. În cea de-a doua etapă enzimatică, s-a utilizat ca selector chiral Acilaza I, o enzimă cu specificitate L, care a catalizat reacţia de hidroliză enantioselectivă la nivelul grupei amidă din -acetilaminoacizii obţinuţi anterior. 4. Compuşii tiazolici chirali sintetizaţi au fost caracterizaţi spectral prin 1 H RM, 13 C RM, M şi s-au determinat configuraţia absolută şi rotaţia optică specifică.

DCTRAL THEI UMMARY tereoselective chemoenzymatic synthesis of chiral thiazolic compounds PhD tudent Denisa Hapău Coordinators Prof.dr. Valentin Zaharia Prof.dr. ing. Florin Dan Irimie, "Babeş-Bolyai" University of Cluj-apoca

1. tereoselective chemoenzymatic synthesis of chiral thiazolic compounds 13 TABLE F CTET ITRDUCTI 11 TATE F THE ART 1. Compounds with thiazole structure 15 1.1. Methods for obtaining thiazolic compounds 15 1.2. Chemical and biological properties of the thiazolic compounds 16 2. tereoselective synthesis. Biocatalysis. 19 2.1. Kinetic resolution. Dinamic kinetic resolution 20 2.2. Enzymatic reactions catalyzed by lipases 21 3. Methods for the synthesis of optically active secondary alcohols 25 3.3.1. Asymmetric bioreductions of prochiral ketones 25 3.3.2. Asymmetric hydroxylation 27 3.3.3. Asymmetric aldolic condensation 29 3.3.4. Enzymatic kinetic resolution 30 4. Methods for the synthesis of optically active -aminoacids 31 4.4.1. Reductive amination of -ketoacids 31 4.4.2. tereoselective transformations catalyzed by ammonia liases 33 4.4.3. Transamination catalyzed by aminotransferases 34 4.4.4. Enzymatic kinetic resolution of -aminoacids and their derivatives 35 5. Conclusions 37 PERAL CTRIBUTI 1. bjectives 41 2. General methodology 43 3. ynthesis of optically active 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols by enzymatic kinetic resolution 47 3.1. Introduction 47 3.2. The work hypothesis 47 3.3. Material and method 48 3.4. Results and discussions 49 3.4.1. ynthesis of substrates for the enzymatic reactions 49 3.4.2. Analytical scale enzymatic acylation of 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols rac-3a-d 51 3.4.3. Analytical scale enzymatic alcoholysis of rac-4a-d 52 3.4.4. Preparative scale enzymatic synthesis 53 3.4.5. Determination of the absolute configuration of the optically active thiazole products 57 3.5. Conclusions 59 3.6. Experimental part 59 4. ynthesis of optically active 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols by enzymatic kinetic resolution 4.1. Introduction 65 4.2. The work hypothesis 66 4.3. Material and method 66 4.4. Results and discussions 67 4.4.1. ynthesis of racemic thiazol-5-yl ethanols 67 4.4.2. Analytical scale enzymatic acylation of rac-6a-d 68 4.4.3. Analytical scale enzymatic alcoholysis of rac-7a-d 69 4.4.4. Preparative scale enzymatic synthesis 70 4.4.5. Determination of the absolute configuration of the products obtained by enzymatic 73 65

14 Hapău Denisa kinetic resolution 4.5. Conclusions 74 4.6. Experimental part 75 5. Chemoenzymatic synthesis of L- -aminoacids with thiazole structure 5.1. Introduction 81 5.2. The work hypothesis 82 5.3. Material and method 84 5.4. Results and discussions 84 5.4.1. ynthesis of the precursors for the enzymatic reactions 84 5.4.2. tereoselective chemoenzymatic synthesis of L- -aminoacids 85 5.5. Conclusions 93 5.6. Experimental part 94 6. General discussions 101 7. General conclusions 105 8. The originality and innovative contributions of the thesis 107 REFERECE 109 Keywords: thiazole, kinetic resolution, biocatalysis, secondary alcohols, -aminoacids Introduction tereoselective reactions are occupying a large area, both by the implications of the stereoselectivity in the transformations of the living organisms, and also by their potential applications for the stereocontrolled synthesis of new compounds with utilities in the industrial and in the pharmaceutical fields. The chiral functional organic compounds are key substances that can be valorified alone or integrated into more complex structures, in order to obtain new therapeutic agents with new or improved effects, determined by the presence of the stereogenic center. The growing requirement for chiral intermediates in the enantiopure form led to the significant development of the stereoselective synthesis. In the last decade, new stereoselective synthetic methods have been reported in the literature, very different in terms of mechanism, intermediates, reaction conditions and classes of compounds to which it applies. ew directions for the stereocontrolled synthesis are contoured: one of them, conventional, in which the reactions is assisted by a chiral chemocatalyst, and the otherone, modern, highly dynamic, focused on the use of biocatalysts, which are chiral natural compounds. Because the development of a process at industrial scale involves economical and ecological problems, there is currently the tendency to minimize the implementation of those processes that produce waste harmful to the environment and to simplify the technological processes, by using mild reaction conditions. In this regard, the biocatalytic methods are a favorable alternative to the conventional organic chemical processes, as they are carried out under mild reaction conditions, producing biodegradable wastes and there is the possibility of recycling the biocatalyst, if immobilized enzymes are used, that can easily be separated and reused in several cycles without the loss of the activity. These advantages are completed by the lack of the toxicity and the properties of the enzymes, which sometimes are superior to the conventional catalysts (chemoselectivity, regioselectivity and stereoselectivity). The aim of this thesis is the development of effective chemoenzymatic processes for the synthesis of secondary alcohols and chiral -amino acids containing the thiazole core as potential chiral building blocks in the organic synthesis of new structures with biological potential. ince the position and the nature of the substituents can significantly influence the

1. tereoselective chemoenzymatic synthesis of chiral thiazolic compounds 15 activity and the stereoselectivity of the enzyme for a given substrate, it was necessary to investigate and to optimize separately the enzymatic reactions for the substrates containing the stereogenic center grafted in the 4 th and respectively 5 th position of the thiazole ring. The three main objectives of this study were: 1. The chemoenzymatic synthesis of optically active 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols. 2. The chemoenzymatic synthesis of optically active 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5- yl)ethanols. 3. The chemoenzymatic synthesis of some L- -aminoacids with thiazole structure. Each study involved the following steps: The synthesis of variously functionalized thiazole based precursors; The synthesis of the substrates required for the enzymatic reactions; The establishment of the analytical methods for the separation of the enantiomers from the racemic mixtures, by high performance liquid chromatography with chiral stationary phases. The stereoselective synthesis steps were based on classical or dynamic enzymatic kinetic resolution, under the catalytic action of enzymes from the hydrolases fold family: lipases and aminoacylases. The enzymatic reactions were monitored by analytical HPLC or RP-HPLC on chiral stationary phases. The conversion, the enantiomeric excess ee and the enantiomeric ratio E were calculated based on the obtained chromatograms. Personal contribution tudy 1. ynthesis of optically active 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols by enzymatic kinetic resolution This study aims to investigate the enzymatic kinetic resolution in the series of thiazole derived secondary alcohols, in which the hydroxyethyl group is grafted at the 4 th position of the thiazole ring. For the synthesis of racemic 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols necessary in the enzymatic reactions were applied the steps described in cheme 1. R H 2 + Cl Cl I. Cl II. -H 2 -HCl R 1 1a-d R 2a-d R = a. H ; b. 3- ; c. 4- ; d. 4-Br R rac-3a-d IV. R rac-4a-d cheme 1. ynthesis of 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols and their esters. Reaction conditions: I.1) anhydrous acetone, 24 h, 2) H24 conc, 2 h; II. 1). urotropine, CHCl3, refluxe, 1.5 h, 2) urotropine, CH3CH 50%, refluxe 1 h; 1) CH3MgI, diethylether, refluxe; 2) H4Cl sat.; IV. anhydrous CH2Cl2, (CH3C)2, Et3/DMAP. The substrate rac-3a was acylated using various enzymes, in vinyl acetate. Lipase B from Candida antarctica showed the best activity and enantioselectivity (E>>200). Lipase from Mucor miehei and lipase from Pseudomonas fluorescens presented also good enantioselectivity in the kinetic resolution at conversions over 20%. 1 ince the nature of the solvent could significantly influence the activity and the stereoselectivity of the lipase, the acetylation of rac-3a was investigated in various solvents, with CaL-B and vinyl acetate. While the enantioselectivity of the enzyme was found to be high in most of the cases, a strong solvent influence upon the enzyme activity was observed (Table 1). Toluene proved to be the most appropriate solvent for the efficient CaL-B mediated acetylation of rac-3a. 1 Hapău D, Brem J, Moisă M, Toşa MI, Irimie FD, Zaharia V. erocycles 32. Efficient kinetic resolution of 1-(2-arylthiazol-4-yl) ethanols and their acetates using lipase B from Candida antarctica, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 94: 88-94.

16 Hapău Denisa Table 1. olvent screening for the acylation of rac-3a with CaL-B and vinyl acetate, reaction time: 5.5 h Entry olvent c (%) ee ()-3a (%) ee (R)-4a (%) E 1 n-hexane 37.29 59.16 >99.5»200 2 n-ctane 48.80 94.83 >99.5»200 3 Cyclohexane 45.95 84.60 >99.5»200 4 Chloroforme 1.66 1.68 >99.5»200 5 Toluene 49.75 98.50 >99.5»200 6 Diizopropylether 37.35 59.31 >99.5»200 7 Tetrahydrofurane 29.39 40.15 96.48 82.78 8 Acetonitrile 41.08 69.37 >99.5»200 9 Methyl tert-butyl ether 38.92 63.31 99.35»200 The same protocol was successfully used also for the kinetic resolution of alcohols rac-3bd (E>>200, c ~50% after 6-9 hours). Lipases are presenting the same enantiopreference in both acylation and alcoholysis process. Therefore, by lipase-mediated kinetic resolution can be obtained the -enantiomers, by enantioselective acylation of alcohols, as well as the R-enantiomers, by enantioselective alcoholysis of the corresponding esters. In order to obtain the opposite enantiomers of the resolution products, (R)-3a-d and ()- 4a-d, the CaL-B catalyzed enzymatic alcoholysis of the racemic esters rac-4a-d was further investigated, in various solvents and in the presence of methanol as nucleophile. The best stereoselectivity was obtained in methyl tert-butyl ether as solvent (E>200). Both in the case of acylation as well as alcoholysis, a low enzyme activity was observed for the transformation of the substrate derived from p-bromophenylthiazole. The optimal reaction conditions found were applied for the preparative scale synthesis of 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols and their acetic esters, in both enantiomeric forms (cheme 2). + II. rac-3a-d (R)-4a-d ()-3a-d I. + rac-4a-d (R)-3a-d ()-4a-d cheme 2. Chemoenzymatic synthesis of (R)- and ()-1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols 3a-d and their esters. Reaction conditions: I. (CH3C)2, DMAP/Et3/CH2Cl2; II. CaL-B, vinyl acetate, toluene; CaL-B, MeH/MTBE. Table 2. Yields, enantiomeric excesses and specific optical rotations for the enzymatic kinetic resolution products (R)-, ()-3,4a-d Entry Product % ee (%) [ ] D 1 Product (%) ee (%) [ ] D 3 1 ()-3a 48 >99.5-8.60 (R)-3a 48 98 +8.1 2 ()-3b 48 98.5-7.00 (R)-3b 47 >99.5 +7.2 3 ()-3c 49 >99.5-6.80 (R)-3c 48 >99.5 +7.0 4 ()-3d 48 >99.5-10.25 (R)-3d 48 98 +9.8 5 (R)-4a 48 99 +126.4 ()-4a 49 99-126.0 6 (R)-4b 47 >99.5 +119 ()-4b 47 98-117.5 7 (R)-4c 48 99 +112.8 ()-4c 46 98-111.3 8 (R)-4d 47 99.3 +97 ()-4d 49 90-88.3 1c 1.0, CHCl3, 25ºC Br a. b. c. d.

1. tereoselective chemoenzymatic synthesis of chiral thiazolic compounds 17 The chromatograms for the kinetic resolution of rac-3,4a are presented in Fig. 1-3. 1 Fig.1. HPLC separation of the enantiomers of rac-3,4a on Chiralpak IB column, mobile phase n-hexane: 2-propanol = 99:1 80:20 (v/v). Gradient separation procedure: 0-9 min: 1% iprh; 9.1-16 min.: 20% iprh. Fig.2. CaL-B mediated kinetic resolution of rac-3a with vinyl acetate, in toluene. Fig.3. CaL-B catalyzed methanolysis of rac-4a in methyl tert-butyl ether Conclusions An efficient stereoselective chemoenzymatic method was elaborated for the production of new 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols and their acetates, in both enantiomeric forms. For the enantioselective acylation process, the best results were obtained using CaL-B (5 mg/ml), vinyl acetate (4 equiv) and toluene as solvent. CaL-B proved to be an efficient biocatalyst also for the methanolysis of the corresponding acetates rac-4a-d, in methyl tert-butyl ether as solvent. The secondary alcohols ()-3a-d and their acetates (R)-4a-d were obtained with high enantiopurities and yields (ee>98.5%) by CaL-B mediated kinetic resolution of the corresponding racemic alcohols. The opposite enantiomeric forms (R)-3a-d and ()-4a-d were obtained by the CaL-B catalyzed enantioselective methanolysis of the esters rac-4a-d. tudy 2. ynthesis of optically active 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols by enzymatic kinetic resolution The objective of this study is to develop a stereoselective chemoenzymatic process based on the kinetic resolution of chiral thiazolic secondary alcohols, in which the hydroxyethyl group is grafted in position 5 of the thiazole ring. 1 Hapău D, Brem J, Moisă M, Toşa MI, Irimie FD, Zaharia V. erocycles 32. Efficient kinetic resolution of 1-(2-arylthiazol-4-yl) ethanols and their acetates using lipase B from Candida antarctica, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2013, 94: 88-94.

18 Hapău Denisa The thiazole derived secondary alcohols rac-6a-d and their corresponding esters, necessary in the enzymatic reactions, were synthesized as described in cheme 3. H 2 + R 1 Cl CH I. 3 II. -H 2 -HCl R 1 5a-d CH3 R 1 rac-6a-d R 1 = a. H ; b. 3- ; c. 4- ; d. 4-Br R 2 = n-pr (rac-7a-d); Et (rac-7'a-d); Me (rac-7''a-d) cheme 3. ynthesis of 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols and their esters. Reactions conditions: I.1). anhydrous acetone, 24h, 2). H24 conc., 2h; II. abh4, methanol; (RC)2, Et3/DMAP, anhydrous dichloromethane. R 1 rac-7a-d The racemic alcohol rac-6a was used as model substrate for the optimization of the enzymatic kinetic resolution. First the acetylation of rac-6a in the presence of several enzymes (lipase B from Candida antarctica (CaL-B), lipase A from Candida antarctica (CaL-A), lipase from Rhyzopus oryzae, lipase from porcine pancreas, lipase from Pseudomonas fluorescens, lipase from Candida rugosa, lipase from Mucor miehei, lipase from Burkholderia cepacia) in pure vinyl acetate was tested. CaL-B was found as the most selective enzyme for the kinetic resolution and it was chosen as biocatalyst in the following experiments. The CaL-B selectivity for the transformation of rac-6a was evaluated in the presence of diverse solvents and various acylating agents. The best enantiopurities were obtained in cyclohexane (Table 3) and with vinyl butanoate as acylating agent (Table 4). 1 Table 3. olvent screening for the acetylation of rac-6a catalyzed by CaL-B, with vinyl acetate, reaction time: 36 h Entry olvent c(%) ee ()-6a (%) ee (R)-7a (%) E 1 n-hexane 53 97 87 58 2 n-ctane 53 97 86 54 3 Cyclohexane 52 98 92 102 4 Chloroforme 24 30 97 81 5 Toluene 50 94 93 92 6 Diizopropyl ether 45 78 94 83 7 Tetrahydrofurane 26 97 34 87 8 Acetonitrile 39 96 61 87 9 Methyl tert-butyl ether 49 88 93 77 Table 4. CaL-B mediated kinetic resolution for rac-6a-d with various acylating agents, in cyclohexane as solvent Time c ee (R)-7a-d ee ()-6a-d Entry Acylating agent ubstrate (ore) (%) (%) (%) 1 Vinyl acetate rac-6a 36 52 92 98 110 2 Vinyl propanoate rac-6a 65 50 96 94 174 3 Vinyl butanoate rac-6a 65 50 98 98»200 4 Vinyl butanoate rac-6b 45 50 97 97»200 5 Vinyl butanoate rac-6c 19 49 >99.5 97»200 6 Vinyl butanoate rac-6d 69 50 98 >99.5»200 everal lipases in various solvents and in presence of various nucleophiles (methanol, ethanol, propanol and butanol) were tested for the alcoholysis of the esters rac-7a-d, but in the most cases the enzymes showed poor activity. nly CaL-A proved to be an efficient biocatalyst for the enzymatic alcoholysis of rac-7a-d. The best results were obtained using the enzyme CaL- A CLEA (Candida antarctica lipase A reticulated with glutaraldehyde), in diisopropyl ether, in the presence of methanol as nucleophile (ee>99.5%, E>200). E R 2 1 Hapău D, Brem J, Zaharia V. erocycles 30: Lipase catalyzed kinetic resolution of racemic 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5- yl)ethanols, Tetrahedron Asymmetry 2011, 22(24): 2165-2171.

1. tereoselective chemoenzymatic synthesis of chiral thiazolic compounds 19 Using the optimal conditions found at the analytical scale, the preparative scale enzymatic synthesis of 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols and their butanoates in both enantiomeric forms was performed (cheme 4). II. rac-6a-d (R)-7a-d ()-6a-d I. + c. + d. Br rac-7a-d (R)-6a-d ()-7a-d cheme 4. Enzymatic kinetic resolution in the seris of 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols. Reaction conditions: I. (CH3CH2CH2C)2, Et3/DMAP, CH2Cl2; II. CaL-B, vinyl butanoate, cyclohexane; CaL-A, MeH/DIPE. Table 5. Yields, enantiomeric excesses and optical rotations for ()- and (R)-6,7a-d Entry Product 1 % ee (%) [ ] 3 D Product 1 (%) ee (%) [ ] 3 D 1 ()-6a 45 98.5-53.4 (R)-6a 41 >99.5 +52.8 2 ()-6b 45 98.5-56.0 (R)-6b 40 >99.5 +56.8 3 ()-6c 46 92.0-54.0 (R)-6c 42 >99.5 +57.6 4 ()-6d 44 91.5-40.0 (R)-6d 39 >99.5 +44.5 5 (R)-7a 44 98.0 +152 ()-7a 45 98.6-152.4 6 (R)-7b 44 97.0 +144 ()-7b 44 98.2-144.8 7 (R)-7c 45 >99.5 +167.6 ()-7c 46 >99.5-167.5 8 (R)-7d 43 96.2 +99.2 ()-7d 44 97.3-99.4 1 c 1.0, CHCl 3, 25 C Conclusions A series of new optically active 1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols were obtained in both enantiomeric forms, by kinetic resolution processes mediated by the enzymes CaL-B and CaL-A. The enantioselective enzymatic acylation was performed under the catalytic action of the enzyme CaL-B, with vinyl butanoate as acylating agent and in cyclohexane as solvent, resulting the ()-1-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)ethanols with enantiomeric excesses of 91.5-98.5%. The thiazolic alcohols with R configuration were obtained by the enzymatic methanolysis of the corresponding butanoic esters, using CaL-A, in diizopropyl as solvent. tudy 3. Chemoenzymatic synthesis of L- -aminoacids with thiazole structure The aim of this study was to elaborate a chemoenzymatic method based on conventional or dynamic kinetic resolution processes, in order to obtain a series of L- -2-arylthiazole-4-yl alanines, starting from the corresponding racemic -acetyl amino acids. The key step in the stereoselective synthesis is the dynamic kinetic resolution (DKR) of thiazolic oxazol-5(4h)-ones, by the enantioselective ring-opening reaction using aliphatic alcohols as nucleophiles under the catalytic action of lipases (cheme 5). The main requirements for this method to be effective are: the ability of lipase to accept and transform stereoselectively the substrate, the capacity of the untransformed substrate to racemize with a sufficiently high rate, as wel as the capacity of the oxazolone-substrate to resist to the nucleophilic attack of the alcohol without the participation of the enzyme. a. b.

20 Hapău Denisa + R H lipase fast R HC H 2 CH k invr- k inv-r + R H lipase slow R HC = cheme 5. Dynamic kinetic resolution of the thiazolic oxazol-5(4h)-ones Another enzymatic methodology applied in this study consists in the L-enantioselective hydrolysis of the amide bond of thiazolic -acetyl- -aminoacids, using aminoacylase as biocatalyst. (cheme 6). CH HC Aminoacylase + H 2 ph 8-9 - CH3 CH CH + H 2 CH HC cheme 6. Enantioselective enzymatic hydrolysis of the thiazolic -acetyl- -aminoacids The synthesis of thiazolic amino acids rac-12a-d and their derivatives, necessary in the enzymatic kinetic resolution process, is described in cheme 7. I. EtC CEt II. Cl CH HC HC 1a-d 8a-d rac-9a-d IV. V. CR HC rac-10a-d rac-11a-d CH H 2 rac-12a-d cheme 7. The synthesis of racemic 2-arylthiazol-4-yl alanines and their derivatives. Reagents and reaction conditions: I. ah, CH3CHCH(CEt)2/DMF, 60⁰C; II. a). KH 10%, refluxe 4h; b). toluene, refluxe 2h; Alcohol (MeH,EtH,n-PrH, n-buh), carbonyldiimidazole/thf; IV. DCC/CH2Cl2; V. HCl 18%, refluxe 4h. The first stereoselective enzymatic step was the lipase catalyzed DKR of oxazolones rac- 11a-d, with the participation of alcohols as nucleophiles. The reaction products, - acetylaminoesters L-10a-d, were hydrolyzed at the ester group, in mild basic conditions. The resulting L-2-acetamido-3-(2-arylthiazol-4-yl)propanoic acids L-9a-d were enzymatically hydrolyzed at the amide function, under the catalytic action of Acylase I. (cheme 8). B rac-11a-d I. CR HC II. CH HC CH H 2 L-10a-d L-9a-d (ee 72-80%) L-12a-d (ee>99%) = a R = Et / n-pr cheme 8. tereoselective chemoenzymatic synthesis of L-(2-arylthiazol-4-yl)alanines and their derivatives. Reagents and conditions: I. CaL-B, ethanol (for the DKR of rac-11a-c) / n-propanol (for the DKR of rac-11d), acetonitrile; II. a2c3/h2, refluxe; Acylase I, ph 8. b c Cl d

1. tereoselective chemoenzymatic synthesis of chiral thiazolic compounds 21 Different reaction conditions (enzyme, nucleophile, solvent, racemisation catalyst) were investigated for the stereoselective ring-opening of the oxazol-5(4h)-ones rac-11a-d. For the transformation of the substrates rac-11a-c, the best enantiopurities were obtained when acetonitrile was used as solvent and ethanol as nucleophile (Table 6, entry 3), using lipase B from Candida antarctica and in the presence of a racemisation catalyst,,diethylaminoethanol immobilised on carbon nanotubes. For the transformation of the substrate rac-11d, the best enantioselectivity was obtained with n-propanol as nucleophile, in acetonitrile (76% ee). Table 6. olvent screening for the enantioselective alcoholysis of the oxazolone rac-11a, with CaL-B and ethanol, in the presence of the racemisation catalyst (diethylaminoethanol immobilized on carbon nanotubes) Entry olvent ee p % 1. 1,4-Dioxane 60.4 2. Toluene 60.6 3. Acetonitrile 80.0 4. Tetrahydrofurane 64.0 1 5. Diethylether 30.4 The enzymatic kinetic resolution at preparative scale of the oxazolones rac-11a-d was performed in the optimal reaction conditions found, resulting the L-2-acetamido-3-(2- arylthiazol-4-yl)propanoic esters L-10a-d with 72-76% ee and 77-81% yields. The DKR products L-10a-d were hydrolyzed at the ester group in mild basic conditions. In order to increase the enantiopurity and to obtain the final products in enantiopure form, the next step was the enantioselective enzymatic hydrolysis at the amide group of the -acetyl aminoacids L-9a-d, using Acylase I, in aqueous media. By this method, the thiazolic amino acids L-12a-d were obtained, with enantiomeric excesses over 99%, with 55-58% global yields. Conclusions A chemoenzymatic method was optimized for the synthesis of a series of L-(2-arylthiazol- 4-yl)alanines in enantiopure form, starting from the corresponding -acetyl amino acids. The first chiral selector was lipase B from Candida antarctica, in a DKR process based on the stereoselective ring-opening of the thiazolic oxazol-5(4h)ones, in organic media. By this process, the -acetylated and esterified L-amino acids were obtained (ee = 72-76%), in 77-81% global yields. The DKR products were hydrolyzed at the ester function in mild basic conditions, followed by the enantioselective hydrolysis of the amide group, catalyzed by Acylase I, in aqueous media. Due to the substrate L-specificity of Acylase, I, the enantiomeric exces of the final products was increased to 99%. General conclusions 1. A series of racemic 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols was obtained, by the addition of methylmagnesium iodide to the corresponding 2-arylthiazol-4-carbaldehydes. Two stereoselective enzymatic processes based on kinetic resolution were elaborated for the separation of the racemic 1-(2-arylthiazol-4-yl)ethanols and their -acetylated derivatives. The optimal reaction conditions were established (enzyme, solvent, acylating agent, nucleophile). The best results were otained with lipase B from Candida antarctica, in both enantioselective acylation process of racemic thiazol-4-yl ethanols, with vinyl acetate in toluene, and in the methanolysis of the corresonding acetic esters, in methyl tert-butyl ether. By these methods, the secondary chiral alcohols and their acetic esters were obtained, in both enantiomeric forms, with high yields and enantiopurities. 2. A series of racemic 1-(2-aryl-4-methylthiazol-5-yl)ethanols were obtained, by reduction with sodium borohydride of the corresponding 2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl-ethanones.