Biochimie - Curs Structura acizilor nucleici În orice organism acizii nucleici constituie o sursă care codează informaţia biologică. Forma şi

Transcriere

1 Structura acizilor nucleici În orice organism acizii nucleici constituie o sursă care codează informaţia biologică. Forma şi activităţile diverselor celule sunt în mare măsură determinate de instrucţiunile genetice conţinute de ADN (sau ARN în unele virusuri). În conformitate cu dogma centrală a biologiei moleculare, secvenţa de baze nucleotidice din ADN codează secvenţa aminoacizilor din proteine. Multe proteine din celulă sunt enzime care participă în procesele metabolice. Alte proteine au rol participa în menţinerea şi transmiterea informaţiei genetice. Există două tipuri de acizi nucleici, ADN-ul și ARN-ul, care sunt purtători ai informaţiei genetice şi determină ca această informaţie să fie disponibilă pentru celulă. Structurile acestor molecule trebuie să fie în concordanţă cu următoarele aspecte: 1. Informaţia genetică trebuie păstrată într-o formă stabilă pentru o perioadă îndelungată. 2. Informaţia genetică trebuie sa fie decodată înainte de a fi utilizată. Transcripţia este procesul în care secvenţa nucleotidelor din ADN este copiată sub forma ARN-ului mesager în aşa manieră încât să determine sinteza proteinelor (proces de translaţie care se desfășoară în ribozomi). 3. Informaţia conţinută pe ADN sau ARN trebuie să fie accesibilă atât proteinelor cât şi acizilor nucleici. Aceşti agenţi pot recunoaşte (se pot lega de) acizii nucleici astfel încât să poată determina schimbări ale funcţiilor acestor molecule. 4. Progenitorii unui organism trebuie să fie echipaţi cu acelaşi set de instrucţiuni ca ale părintelui. Astfel, ADN-ul este replicat (copiat) astfel încât celulele nou formate să primească aceeaşi informaţie genetică. În general, este acceptat faptul că pentru exercitarea funcţiei lor acizii nucleici necesită şi unele componente celulare. Structura elicoidală a ADN-ului Perioada de după anii 1900 până la cel de-al doilea Razboi Mondial a fost considerată vârsta de aur a geneticii. Cu toate acestea cercetătorii nu au reuşit să confirme faptul că ADN-ul şi nu proteinele constituie materialul ereditar. Oricum, această perioadă s-a distins printr-o serie de descoperiri genetice care au permis stabilirea unor corelaţii între genetică şi evoluţie. În 1869, F. Miescher a izolat ADN-ul din leucocite. Acesta a colectat puroiul (care conţine o cantitate apreciabilă de leucocite) din bandajele folosite la un spital, după care a îndepărtat acest lichid de pe bandaje utilizând o soluţie salină. După adăugarea unei soluţii slab alcaline peste celulele albe a constat faptul că nucleele precipită din soluţie. Meischer a observat faptul că aceasta substanţă din nucleu, numită nucleină, are un raport constant fosfor:azot (P:N). ADN-ul s-a dovedit a fi unul din principalii componenţi ai nucleului (Mendel şi Darwin au publicat descoperirea lor în acelaşi timp). Deoarece s-a izolat din nucleu, initial compusul (ADN-ul) a fost numit nucleină. Mai târziu a fost denumit acid nucleic şi în ultima instanţă acid deoxiribonucleic (ADN). 1

2 Principalele baze din acizii nucleici În 1914 R. Feulgen a arătat faptul că fuxina (colorant) poate lega ADN-ul. Acestă proprietate a fost folosită pentru localizarea ADN-ului în nucleul celulelor eucariote. În 1920, P.A. Levene a analizat componentele moleculei de ADN. Studiile sale au dovedit faptul că ADN-ul conține 4 baze purinice/pirimidinice (Figura 1) legate de o deoxiriboză pe care este grefată o grupare fosfat (Figura 2). Figura 1. Structura chimică a celor patru baze din componența ADN-ului Acest amsamblu (baza+deoxiriboză+grupare fosfat) formează nucleotidele, monomeri care intră în constituţia ADN-ului (polimer). De remarcat este faptul că nucleozidele au în componenţă numai bază şi deoxiriboza. Într-o nucleotidă baza este ataşată prin intermediul unei legături N-glicozidice la atomul de carbon 1 din deoxiriboză în timp ce gruparea fosfat este grefată la atomul de carbon din pozitia 5. Nucleotidele sunt legate prin legături fosfodiesterice (Figura 2): o gruparea fosfat se leagă de două zaharuri diferite prin intermediul grupărilor hidroxil din poziţia C3 de la unul dintre carbohidraţi şi poziţia C5 de la celălalt carbohidrat. Deşi Levene a propus corect modul de legare a nucleotidelor, el a lansat o ipoteză greşită în ceea ce priveşte distribuţia nucleotidelor în molecula de ADN, presupunând că nucleotidele se află grupate în serii de câte patru, care au aceeaşi ordine în lanţul polinucleotidic. Erwin Chargaff a izolat ADN-ul din diverse surse şi a măsurat ponderea fiecărei baze (purinice sau pirimidinice). Din datele sale experimentale a reieşit faptul că ponderile adeninei şi timinei (respectiv cele pentru guanină şi citozină) sunt egale, însă cele ale adeninei şi guaninei sunt diferite. Asftel, s-a infirmat teoria lui Levene conform căreia tetranucleotida era unitatea structurală de bază a ADN-ului. 2 Figura 2. Structura chimică a unei tetranucleotide

3 După 1900 Garrod a propus o legătură între gene şi metabolismul existent la naştere. Una din întrebările care au survenit în acea perioadă a fost următoarea: ce este o genă? Răspunsul a venit după 20 de ani atunci când F. Griffith a studiat diferenţa dintre două tipuri de bacterii (una care cauzează pneumonia-s şi alta care nu cauzează pneumonia-r). Tipul S de bacterie era încapsulat, pe când tipul R nu. Griffith a demonstrat (1928) faptul că un tip de bacterie nepatogenic poate deveni patogenic prin intermediul unui factor de transformare. Cercetătorul a injectat diferite tipuri de bacterii în șoarece şi a constatat faptul că tipul S induce moartea, în timp ce tipul R nu afectează organismul. Mai mult, folosind tipul S al bacteriei care este distrus de temperatură a observat faptul că organismul a supravieţuit. Combinarea ultimului tip de bacterie (distrusă prin încălzire) cu tipul R (nepatogen) a indus apariţia pneumoniei, respectiv a decesului. În anul 1944, O. Avery, C. MacLeod și M. McCarty au concluzionat faptul că factorul de transformare este de fapt ADN-ul. Dovada că ADN-ul este materialul ereditar a fost adusă de M. DelBruck şi S. Luria. Aceştia au analizat bacteriofagele, un tip de virus (conţinând un inveliş proteic care încapsulează ADN-ul) care atacă bacteriile E.Coli (din intestinul gros). În 1952, A. D. Hershey şi M. Chase au demonstrat prin marcare cu radioizotopi a bacteriofagelor ( 32 P pentru ADN şi 35 S pentru proteină) faptul că ADN-ul (care s-a regăsit în celula infectată) este purtătorul fizic al informaţiei genetice. Structura ADN-ului ADN-ul este un polimer care are două lanţuri de deoxinucleotide, molecule care sunt legate prin legături fosfodiesterice. Cea mai cunoscută formă a ADN-ului este aceea a B-ADN-ului, care are trăsăturile structurale a ADN-ului descris de J. Watson şi F. Crick, împreună cu R. Franklin şi colaboratorii acesteia: 1. Cele două lanţuri antiparalele sunt rotite spre dreapta în jurul unei axe comune rezultând o structură elicoidală al cărei diametru este de aproximativ 20 Å. 2. Planele formate de bazele nucleotidice, care formează perechi de legături de hidrogen, sunt aproximativ perpendiculare pe axa centrală a helixului. În B-ADN, bazele ocupă miezul helixului iar resturile de fosfozahar se regăsesc în afara acestuia, formând adâncituri majore sau minore. Doar porţiuni mici din perechile de baze sunt expuse spre exterior. 3. Fiecare pereche de baze are aproximativ aceeaşi înclinaţie, ceea ce conferă o simetrie moleculei de ADN. Perechile de baze A-T şi G-C (Figura 3) pot fi interschimbabile fără să afecteze poziţia resturilor de zahar din afara helixului. Guanina formează 3 legături de hidrogen cu citozina, iar adenina 2 legături de hidrogen cu timina. Alte perechi de baze perturbă semnificativ dispunerea de tip bielicoidal. 4. B-ADN helixul are 10 perechi de baze (eng. base pairs = bp) pentru o rotaţie completă şi pasul de 34 Å. 3 Figura 3. Interacțiuni între bazele nucleotidice din lanțurile ADN-ului dublu-catenar Pentru a demonstra trăsăturile structurale ale ADN-ului Watson şi Crick s-au bazat pe informaţiile provenite din modul de difracţie al razelor X de către această

4 moleculă. În practică un fascicul de raze X este direcţionat spre un cristalul unei substanţe. După bombardarea cristalului unele raze sunt împraştiate sau reflectate în momentul în care întâlnesc atomi. Razele X împrăştiate pot interfera între ele şi produc spoturi de diferite intensităţi, care pot fi înregistrate sub forma unei hărţi. Difractograma (harta rezultată) este asemenea unei semnături caracteristice fiecărei molecule. R. Franklin şi W. Maurice au obţinut difractogramele specifice ADN-ului. Din aceste fotografii reieşea faptul că molecula de ADN este simetrică. Distribuţia sub forma literei X, din fotografie, este o dovadă a structurii elicoidale a ADN-ului. Într-o difractogramă de raze X cu cât spoturile sunt mai apropiate, cu atât distanţa este mai mare. Astfel barele orizontale corespund de fapt cu pasului helixului. Distanţa verticală dintre bare, 34 Å, este o măsură a înălţimii pasului. Distanţa de la mijlocul difractogramei la partea de sus a acesteia, 3,4 Å, este echivalentă cu distanţa dintre două baze suprapuse. Dat fiind faptul că înălţimea pasului era de 34 Å iar distanţa dintre baze 3,4 Å cercetătorii au dedus numărul de baze pe pas - 10 nucleotide. Pasul helixului poate fi calculat din unghiul pe care X-ul îl face cu axa orizontală. Astfel, dacă unghiul este mai mare pasul este mai mic, iar ADN-ul mai compact. Din difractograma obținută s-a dedus faptul că ADN-ul prezintă o modalitate de împachetare dublu-elicoidală cu grupările fosfat orientate spre exterior, iar bazele în interior. Watson şi Crick erau în concurenţă cu Pauling în rezolvarea structurii tridimensionale a ADN-ului. Ultimul, după ce a rezolvat structura -helixului din proteine, încerca să deslușească şi structura ADN-ului. Aproape în acelaşi timp Pauling a trimis o publicaţie despre structura ADN-ului. Watson şi Crick au verificat structura lui Pauling cu ajutorul unui model cu bile şi bețe, structura care s-a dovedit a fi un triplu-helix. Distribuţia grupărilor fosfat era în centrul helixului, iar bazele în exteriorul acestuia. Această orientare a grupărilor fosfat în interiorul helixului era practic imposibilă datorită repulsiilor electrostatice dintre sarcinile negative, lucru care ar fi îngreunat împachetarea moleculei. Figura 4. Cele mai cunoscute variante de împachetare ale ADN-ului dublu catenar (A, B şi Z) Strcutura dublu-elicoidală poate avea câteva împachetări distincte în funcție de compoziţia solventului şi secvenţa de baze. Varianta de ADN propusă de Watson și Crick era aceea B-ADN-ului (Figura 4). Mai târziu au fost propuse și alte variante structurale ale ADN-ului: A-ADNul şi Z-ADN-ul. 4

5 Perechile de baze ale A-ADN-ului sunt inclinate în raport cu axa helixului În condiții de deshidratare B-ADN-ul suferă schimbări conformaționale reversibile și este transformat în A-ADN o macromoleculă a cărei structură este mai aplatizată și mai largă decât aceea a B-ADN-ului. A-ADNul are 11,6 bp pe rotație și pasul de 34 Å. Diferenta majoră dintre B-ADN și A-ADN este aceea că perechile de baze sunt inclinate cu un unghi de 20º în raport cu axa helixului. Mai mult, A-ADN-ul are adâncituri majore mai profunde comparativ cu B-ADN-ul. Z-ADN-ul formează un helix orientat spre stânga La 25 de ani de la descoperirea B-ADN-ului, studiul structurii deoxi(cgcgcg) de către A. Wang și A. Rich a evidenţiat o altă modalitate de împachetare a ADN-ului. Lanțurile acestui tip de ADN s-au dovedit a fi orientare spre stânga (Z-ADN). Acest tip de ADN are 12 bp pe rotaţie şi pasul de 44 Å, adâncitura minoră mai profundă, iar adâncitura majoră se distinge mai puţin. Difracţia fibrelor şi studiile RMN au arătat faptul că polinucleotidele complementare cu purinele şi pirimidinele afectate (de exemplu poli d(gc) poli d(gc) sau poli d(ac) poli d(gc)) adoptă conformaţia Z la o concentraţie mare de sare. Stabilizarea Z-ADN-ului de către săruri se explică prin faptul că repulsiile dintre gruparile fosfat vecine sunt mai atenuate în prezenţa sărurilor. ARN-ul formează un A-helix ARN-ul dublu-helix este materialul genetic al unor virusuri, dar este sintetizat numai sub forma unui singur lanţ. Acest lanţ poate forma punţi de hidrogen intramoleculare formând un lanţ dublu, respectiv bucle (Figura 5). Segmente scurte din lanţul ARN-ului sunt implicate în multiplicarea unor gene. În mod uzual ARN-ul formează conformații de tip A-ADN şi are 11 bp pe rotaţie şi pasul de 30,9 Å, iar perechile de baze sunt înclinate cu aproximativ 16,7º în raport cu axa elicoidului. 5S-rARNul Phe-tARNul (118 nucleotide) (77 nucleotide) Figura 5. Tipuri de structuri ale ARN-ului Flexibilitatea conformaţională a ADN-ului este limitată Conformaţia unei unităţi de nucleotidă indică prezenţa a 6 unghiuri de tor- diferă prin rotația în jurul legăturii N-glicozidice Figura 6. Conformerii sin și anti ai adenozinei siune pentru partea de fosfo-zahar şi un unghi de torsiune atribuit legăturii glicozidice. Rotaţia în jurul legăturii glicozidice este 5

6 impiedicată. Rezidurile purinice posedă două conformaţii, sin şi anti, ultima dintre acestea fiind mai stabilă (Figura 6). În marea majoritate a acizilor nucleici, toate bazele adoptă conformaţia anti. Numai în cazul Z-ADN-ului apar resturi de purină şi pirimidină a căror conformaţie alternează (anti și sin). Conformaţiile plic ale ribozei sunt esenţiale în acizii nucleici, determinând orientarea relativă a substituienţilor fosfat la fiecare rest de riboză. În B-ADN conformaţia este C2 -endo, pe când în A-ADN conformaţia este C3 -endo. În schimb în nucleotidele purinice din Z-ADN au conformaţia de tip 3 -endo iar nucleotidele pirimidice au conformaţia 2 -endo. Proprietăţile ADN-ului în soluţie Moleculele de ADN de diferite dimensiuni pot fi studiate prin diverse metode fizico-chimice. Dimensiunile genomului bacteriofagilor și virușilor variază de la câteva mii de baze (kilobaze) la câteva sute de kilobaze. Genomul bacterian poate varia de la 0,5 Mb la 10 Mb. Genomul eucariotelor este divers și variază de la aproximativ 10 Mb în unele ciuperci la mai mult de Mb în anumite plante. Proprietăţile acido-bazice Grupările fosfat din legăturile diesterice ale ADN-ului, care se repetă periodic în fiecare nucleotidă, au valori scăzute ale pka-ului şi din acest motiv sunt ionizate la valori ale ph-ului mai mari de valoarea 4, fapt care conferă ADN-ului un caracter acid. Grupările fosfat sunt orientate spre exteriorul dublu-helixului şi pot fi interacţiona cu moleculele de apă, ioni divalenţi (Ca 2+, Mg 2+ ) sau amine policationice (spermidina şi spermina-sunt asociate cu moleculele de ADN virale sau bacteriene). Stabilitatea legăturilor de hidrogen din perechile de baze din ADN depinde de gradul de ionizare al gruparilor amino (ph 4-11). Vâscozitatea Rigiditatea şi lungimea apreciabilă a lanţului conferă ADN-ului o vâscozitate apreciabilă. Măsurătorile de vâscozitate sunt folosite pentru a urmări gradul de denaturare al ADN-ului şi implicit gradul de împachetare al duplexului. Coeficientul de sedimentare Coeficientul de sedimentare şi masa moleculară a tipurilor de ADN pot fi determinate prin ultracentrifugare. Masa moleculară a ADN-ului poate fi determinată prin compararea vitezei de sedimentare într-un gradient de densitate de zaharoză cu o probă de ADN cu dimensiuni şi coeficient de sedimentare determinate în prealabil. Sedimentarea la echilibru în gradient de CsCl este folosită pentru determinarea densităţii de plutire a ADN-ului. Moleculele de ADN se concentrează într-o banda stabilă la nivelul care densitatea de plutire este egală cu densitatea CsCl din acea zonă. ADN-ul monocatenar are o densitate mai mare decât ADN-ul dublucatenar, care la rândul său are în general o densitate mai mare decât proteinele. ARN-ul poate fi diferenţiat de ADN (mono sau bicatenar) prin faptul că primul are o densitate mai mare. Densitatea de plutire a ADN-ului poate furniza informaţii referitoare la ponderea perechilor G-C şi A-T din moleculă. Mai mult, ADN-urile virale intacte, omogene, prezintă benzi înguste, în timp ce fragmetele heterogene de ADN din celulele eucariotelor apar sub forma unor benzi (grupuri de benzi) mai largi. 6

7 Denaturarea și renaturarea În cazul în care o soluţie care conţine duplex-adn-ul este încălzită peste o anumită temperatură, structura nativă a acestuia este alterată rezultând separat cele două lanţuri complementare care au conformaţii aleatorii (Figura 7). Astfel procesul de denaturare este însoţit de schimbări calitative în cazul proprietăţilor fizice ale ADN-ului (scăderea vâscozităţii şi creşterea absorbanţei în UV în cazul formei denaturate). Denaturarea ADNului este un fenomen cooperativ în care alterările dintr-o parte a moleculei destabilizează celelalte legături (dintre cele două lanţuri rămase). Această denaturare are loc într-un interval îngust de temperatură. Mijlocul acestui interval poartă numele de temperatură de topire, Tm (m = eng. melting-topire). Stabilitatea duplex-adn-ului (ilustrată de Tm) depinde de o serie de factori: Figura 7. Denaturarea (desfacerea) ADN-ului dublu-catenar în mono-catenar natura solventului, tăria ionică, conţinutul de perechi G-C (care conţin o legătură de hidrogen suplimentară în comparaţie cu perechea A-T) sau de ph. În 1960, J. Marmur a arătat faptul că ADN-ul denaturat poate fi renaturat (să revină la starea iniţială) în condiţiile în care temperatura este menţinută cu 25 mai jos decât Tm. Perechile de baze Împerecherea bazelor este asemeni unui relipiri a celor două lanţuri din acizii nucleici. În cazul modelului proous de Watson și Crick aceste perechi de baze se formează între oligonucleotide complementare. Există însă şi situaţii diferite. De exemplu, perechea de baze A-T poate avea atomul de azot din poziția 7 (perechea Hoogsteen) drept acceptor şi nu cel din pozitia 1 care corespunde situaţiei clasice (modelului Watson-Crick). Oricum, măsurătorile experimentale au arătat faptul că numai perechile de baze Watson-Crick au o stabilitate mai mare față de celelalte perechi. Există şi situaţii diferite în care segmentele ce se împachetează dublu-elicoidal, din multe ARNuri, conţin perechi de baze de tipul G-U care au rol în stabilizarea structurii terţiare a acestora. Figura 8. Tipuri de perechi de baze 7

8 Interacţiunile de van der Waals Purinele şi pirimidinele din interiorul structurii dublu elicoidale au tendinţa de a se orienta într-o manieră paralelă prin intermediul interacţiunilor de tip van der Waals (interacţiuni electronice de tip - ) sau hidrofobe. Aceste interacţiuni contribuie în mod esenţial la stabilizarea structurii ADN-ului. Interacţiunile ionice Interacţiunile electrostatice care au loc între grupările fosfat trebuie considerate, alături de legăturile de hidrogen şi interacţiunile hidrofobe din acizii nucleici, factori care contribuie la stabilizarea structurii acizilor nucleici. De exemplu, Tm a duplex-adnului creşte dacă concentraţia ionilor de Na + este mărită. Acest fapt se datorează intercalării acestor ioni între grupările fosfat. Analog ionii divalenţi, Mg 2+, Mn 2+ şi Co 2+ se leagă specific de grupările fosfat şi astfel constituie agenţi de protecţie a acizilor nucleici. Ionii de Mg 2+ joacă de asemenea un rol esenţial în stabilizarea structurilor complexe adoptate de diverse molecule de ARN. Reacția de polimerizare în lanț (PCR-The polymerase chain reaction) Geneticienii au înțeles faptul că sunt necesare mai multe componente pentru a realiza replicarea ADN-ului. În acest scop este nevoie de enzimă denumită ADN polimeraza și de deoxinucleotide care constituie cărămizile de bază ale ADN-ului. Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este o reacție enzimatică de amplificare mediată de primeri (secvențe scurte de ADN) specifici secvențelor de ADN genomic sau clonat. Metoda PCR a fost inventată de Karry Mullis în 1983 și implică utilizarea unor primeri (a căror lungime este de obicei pb) și a unei ADN polimeraze termostabile, cele mai utilizate fiind Taq, Pfu sau Pwo polimeraza. ADN-ul matriță conține secvența țintă, care poate avea de la zeci la zeci de mii de nucleotide lungime. Tehnica PCR standard realizează amplificarea unei singure secvențe de ADN care are o lungime de cel puțin 5 kb (5000 de baze). Long PCR este tehnica prin care se pot amplifica fragmente mai lungi de ADN (de până la 40 kb). A treia variantă de PCR, multiplex, este utilizată pentru amplificarea unor secvențe multiple care au o lungime sub 5 kb. Taq polimeraza catalizează reacția într-un sistem tampon, în care există un exces de perechi de primeri și cele patru fosfat-deoxinucleotide (dntp), generându-se astfel milioane de copii ale secvenței țintă. PCR poate fi utilizat și pentru amplificarea secvenței de ARN, care trebuie convertită inițial în ADN de enzima revers transcriptaza. Spre deosebire de ADN trebuie luată în considerare instabilitatea și susceptibilitatea ARN-ului la degradare. ADN-ul utilizat ca matriță pentru PCR poate proveni din diferite surse: sânge liofilizat, salivă, țesut parafinat, păr. De asemenea reacția PCR poate fi utilizată pentru amplificarea ADN-ului din materiale degradate: mumii sau fosile. Replicarea ADNului in vitro - reactia PCR Reacția PCR este constituită din serii de trei pași esențiali care definesc un ciclu PCR: denaturarea ADN-ului matriță dublu catenar, alinierea perechilor de primeri la matrițele de ADN monocatenar și extinderea enzimatică a primerilor, prin care se produc copii care servesc drept matrițe în ciclurile ulterioare. ADN-ul matriță este suspendat într- 8

9 un amestec alcătuit din apă distilată sterilizată (fără ARN), soluție tampon (ce conține clorura de magneziu), polimeraza (Taq, Pfu sau Pwo polimeraza respectiv un amestec de polimeraze) și cele patru dntp. De asemenea există o pereche de primeri a căror secvențe sunt complementare cu cele ale ADN-ului care flanchează regiunea țintă. Pentru construirea primerilor se iau în considerare următoarele criterii: - trebuie să aibă un conținut de baze în jur de 50% GC; - lungimea trebuie sa fie între pb; - cei doi primeri trebuie să nu formeze duplexuri între ei; - trebuie evitați primerii care conțin bucle; - capătul 3 trebuie să prezinte o complementaritate perfectă cu a ADN-ului țintă; - temperatura de aliniere a primerilor sa fie între ºC; - temperatura la care jumătate din molecule sunt monocatenare și cealaltă jumătate bicatenare este temperatura de topire (Tm). Temperatura de topire poate fi aproximată după formula: T m = 2 (număr de baze A/T) + 4 (număr de baze C/G) Temperatura de aliniere a primerilor este de obicei aleasă cu 5 ºC mai scăzută decât temperatura de topire a ADN-ului. Din acest motiv este foarte importantă alegerea temperaturii de topire a celor doi primeri. Figura 9. Etapele reacției PCR 9

10 Amestecul de reacție este mai întâi încălzit la temperatura de 94 ºC pentru denaturarea (separarea) celor două catene de ADN (Figura 9) și apoi răcit la o temperatură optimă care facilitează alinierea (alipirea acestora la secvența de ADN) primerilor. Primerii sunt orientați unul în amonte și unul în aval față de regiunea ce urmează a fi amplificată, ambii cu capătul 3 spre interiorul secvenței țintă. Poziția relativă a regiunilor complementare ale acestor primeri determină lungimea secvenței de ADN care va fi copiată. În timpul extinderii primerilor ADN polimeraza adaugă progresiv dntp-urile complementar cu secvența matriță, la capătul 3 al fiecărui primer, generându-se asftel o nouă copie. Astfel prin cicluri repetate de răcire și încălzire se poate forma o cantitate semnificativă de ADN a cărui secvență este identică cu aceea a ADN-ului matriță. Rezultatul, după 20 de cicluri de amplificare, este producerea a 2 20 (peste un milion) copii ale ADN-ului matriță. Inițial exista un impediment legat de stabilitatea polimerazei care era utilizată la replicarea ADN-ului. Enzima respectivă se degrada în momentul încălzirii amestecului la temperatură optimă neceară pentru separara lanțurilor ADN-ului dublu-catenar. Din fericire, biologii au extras diverse polimeraze din bacterii termofile, care traiau în medii la temperaturi extreme. Prin această strategie s-au izolat polimeraze rezistente la temperaturi mari. Taq polimeraza este o polimerază termostabilă care a fost extrasă din bacteria Termus acvaticus (bacterie care trăiește în izvoarele calde). Unul dintre dezavantajele folosirii Taq polimerazei este acela al fidelității scăzute (o eroare de copiere la aproximativ 9000 de nucleotide), fapt datorat lipsei activității exonucleazice. În schimb Pfu polimeraza, o polimerază termostabilă (enzima care are în componență tungsten) numită după specia hipertermofilă anaerobă Pyrococcus furiosus (acest organism se dezvoltă la temperaturi de 100 ºC), posedă și activitate de verificare a corectitudinii polimerizării realizând astfel o amplificare cu o acuratețe ridicată a secvenței ADN dorite. Pwo polimeraza a fost izolată din archeobacteria hipertermofilă Pyrococcus woesei. Cele aproximativ 30 de cicluri sunt realizate într-un aparat optimizat să oscileze temperatura pe diferite intervale de timp, numit thermal cycler. Numărul de cicluri PCR trebuie optimizat în functie de numărul de copii țintă dorit. Pornindu-se de la o singură copie, cea mai eficientă reacție de PCR atinge în câteva ore un platou după 40 de cicluri de amplificare. Acest proces este denumit PCR deoarece în decursul fiecărui ciclu cantitatea de ADN se dublează. Mărimea fragmentului de ADN copiat rezultat în urma PCR este controlată prin intermediul unei tehnici de separare numită electroforeză în geluri de agaroză. Aplicații ale tehnicii PCR Unul din exemplele elocvente ale aplicabilității PCR-ului are rezonanță istorică. Această tehnică a permis demascarea unui impostor care pretindea a fi membru al familiei imperiale ruse. În anul anul 1918, Nicolae Romanov II, ultimul țar al Rusiei, împreună cu familia au fost asasinați în timpul revoluției bolșevice. Ei au fost înhumați într-un loc nemarcat. În 1993, oasele lor au fost supuse testului de identificare a ADNului. Acest lucru a fost posibil prin comparerea secvențelor de ADN ale soției țarului Romanov cu acelea ale prințului Philip de Edinburg, soțul regiei Elizabeta II. Interesant, la scurt timp după asasinarea familiei regale, au circulat zvonuri referitoare la 10

11 supraviețuirea unei fiice a țarului, Anastasia, în urma asasinatului. O persoană a convins o parte din nobilimea rusă din Berlin de apartenența sa la familia regală. Mai târziu, această persoană a emigrat în SUA unde a decedat în Prin intermediul unei probe de țesut care era depozitată într-un spital unde aceasta a fost supusă unei intervenții, ADN-ului acesteia a putut fi amplificat. În urma investigațiilor s-a demonstrat faptul că împărăteasa Alexandra și printul Filip nu sunt rude cu această persoană. Mai mult, aplicațiile Reacției PCR sunt diverse: - în criminalistică; - manipularea genetică; - detecția HIV (ADN-ul este izolat din celulele roșii și amplificat cu primeri corespunzători secvențelor HIV); - diagnosticare prenatală a bolilor genetice. Balizele moleculare (BM) Tehnologia balizelor moleculare a fost introdusă începând cu anul 1996 de către Tyagi şi Kramer. În această tehnică o probă fluorescentă (etichetată la unul din capete cu un fluorofor și la altul cu un stingător) a fost utilizată pentru a dovedi prezenţa unor secvenţe complementare atribuite unor acizi nucleici din soluţie. O baliză moleculară este o oligonucleotidă sub formă de ac conţinând o secvenţă ţintă specifică flancată de două secvenţe complementare care pot hibridiza pentru a forma o tijă. Majoritatea probelor au nucleotide; tija poate conţine 5-10 pb. Un fluorofor şi un stingător adecvat sunt plasaţi la capetele 3 şi 5 ale tijei şi semnalul fluorescenţei este mediat de transferul de energie prin rezonanţă. În absenţa secvenţei complementare, fluorescenţa fluoroforului de pe tija balizei (BM) este stinsă de către stingătorul adiacent. Legarea unei BM la secvenţa ţintă induce o disociere a tijei, fapt care determină o creştere a distanţei dintre fluorofor şi stingător, conducând la o creştere a intensităţii fluorescenţei. O BM se poate lega reversibil sau să disocieze de secvenţa ţintă, şi acestă reversibilitate poate afecta sensibilitatea si selectivitatea detecţiei. Performanţa tehnicii este dictată de o serie de factori (temperatură, ph sau conţinutul secvenţei tijei şi buclei). La o temperatură scăzută, o BM este caracterizată prin stabilitate ridicată a intraduplexului chiar în prezenţa secvenţei ţintă. Din acest motiv fluorescenţa este scăzută datorită stingerii intramoleculare a BM care nu hibridizează cu secvenţa ţintă (Figura 10). Figura 10. Tehnica hibridizării ADN-ului La o temperatură optimă, BM va fi instabilă şi va hibridiza cu secvenţa de interes, rezultând un semnal puternic pentru fluorescenţă. În final, la o temperatură mai mare, 11

12 porţiunile de pe tija BM şi complexul BM-ADN ţintă sunt instabile dat fiind faptul că BM rămâne într-o conformaţie liniară. BM pot fi folosite în numeroase aplicaţii: detecţia agenţilor patogeni şi la stabilirea genotipului alelelor. 12