Expresia genelor Metode de analiză a genelor ADN ARNm Proteină Caracter 5 -ATTGCAAGATTACCATGT-3 Catena codogenă (netranscrisă) 3 -TAACGTTCTAATGGTACA-5 Catena anticodogenă (transcrisă) Transcripţie 5 -AUUGCAAGAUUACCAUGU-3 Translaţie ARNm Leu Ala Arg Leu Pro Cys Maturizare Caracter fenotipic normal polipeptid Expresia genelor ADN mut ARNm mut Proteină an Caracter an Analiza genelor 5 -ATTACAAGATTACCATGT-3 mutaţie G 4 A Transcripţie 5 -AUUACAAGAUUACCAUGU-3 Translaţie ARNm mut ADN Secvenţiere PCR Southern-blot ARN Northern-blot RT PCR Hibridare in situ Proteine Western-blot Secvenţiere Analiza funcţiei Leu Thr Arg Leu Pro Cys Caracter fenotipic anormal polipeptid an Hibridare in situ Analiza histochimică Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor nucleici în medicină Obţinerea FR fragmentelor de restricţie prin acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie) Analiza ADN: depistarea mutaţiilor genice diagnostic precis al bolilor genetice (prenatal, postnatal precoce); identificarea polimorfismului individual dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei); depistarea ADN străin (bacterian, viral) diagnosticul bolilor infecţioase şi gradului de infectare. Analiza ARNm: analiza expresiei genice ţesut-specifică; evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice. 1
- 12 kb 10 kb 10 kb 8 kb 2,5 kb 10 kb 6 kb 5 kb 6 kb 5 kb 2,5 kb 6 kb 4 kb 2 kb RFLPs polimorfismul FR la două persoane X şi Z + M PCR reacția de polimerizare în lanț Principiile PCR clonarea in vitro = amplificare Replicare semiconservativă, repetată Specificitatea primerilor sintetici pentru gena ţintă Hibridizarea ADN-ţintă primer complementar: Denaturare termică a ADN - de cercetat Modificarea ciclică a temperaturii: Denaturare Renaturare Sinteză Componentele necesare pentru clonarea in vitro (PCR): ADN de cercetat Primeri specifici secvenţei de clonat Complimentari secvenţelor flancante Taq-polimeraza ADN-polimerază termostabilă Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dntp) Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii: - tº de denaturare ADN - tº de renaturare (ADN+primer) - tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de ADN) Etapele tehnicii PCR A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante B. Repetarea automată a procedurilor de denaturarerenaturare-elongare de 30-35 ori Denaturarea ADN la 96 o C Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor Elongarea catenelor ADN la 72 o C C. Analiza produşilor PCR - electroforeza - colorarea - interpretarea rezultatelor 2
Extragerea ADN Pregătirea componentelor pentru PCR Amplificarea ADN-ţintă Electroforeza produşilor PCR Colorarea şi vizualizarea produşilor PCR Interpretarea rezultatelor Avantajele PCR Metodă rapidă Metodă ieftină Utilizarea cantităţilor mici de material analizat Nu necesită izotopi radioactivi Interpretarea uşoară a rezultatelor Dezavantajele PCR Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice amplificate Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenţei analizate Utilizarea PCR Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile nucleotidice) Identificarea expresiei genice (RT-PCR) Dactiloscopia genomică (filiaţie) Identificarea agenţilor infecţioşi Identificarea gradului de infecţie (quantitative PCR) Identificarea produselor PCR în timp real (Real-Time PCR) Identificarea inserţiilor / deleţiilor Identificarea mutaţiilor punctiforme 3
Identificarea agenţilor infecţioşi Stabilirea paternităţii (filiaţiei) Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR Concentraţiile critice ale substanţelor pentru inhibarea activităţii Taq-polimerazei Substanţa SDS Fenol Etanol Isopropanol CH 3 COONa NaCl EDTA Concentraţia critică >0.005% (m/v) >0.2% (v/v) >1% (v/v) >1% (v/v) >5 mm >25 mm >0.5 mm Dependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia ADN genomic utilizată în PCR. S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 0,5 μg, 2 0,25 μg, 3 0,1 μg, 4 0,02 μg Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR Caracteristica primerilor utilizaţi în PCR Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR Gena Secvenţa Lungimea, baze % G+C Tm, o C ACE AT1 R NOS 5 -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3 24 54 59 5 -GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 25 48 58 5 -CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3 20 65 58 5 -GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3 23 48 55 5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57 5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59 Dependenţa cantităţii produselor PCR de concentraţia ionilor Mg 2+. Concentraţia utilizată de MgCl 2 : 1 2,5mM; 2 5mM. Dependenţa cantităţii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor. În condiţiile PCR s-a utilizat: 1 t o C optimală -5 o C; 2 t o C optimală; 3 t o C optimală +5 o C. Dependenţa cantităţii de ADN amplificat de numărul de cicluri PCR. 1 30 cicluri; 2 35 cicluri; 3 40 cicluri. 4
Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS M 1 2 3 I D G T Analiza electroforetică în gel de agaroză de 2% a produselor PCR rezultate din amplificarea ADN uman cu primeri corespunzători genei ACE. M marcher al lungimii; 1 genotip I/D; 2 genotip D/D; 3 genotip I/I. Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei NOS. M marcher al lungimii; 1 genotip G/G; 2 genotip T/T; 3 genotip G/T. Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R Tehnica Real-time-PCR A C Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I. M marcher al lungimii; 1 genotip A/A; 2 genotip A/C ARMS-PCR Utilizarea tehnicii microarray Izolarea ARN din diferite ţesuturi Izolarea ARNm Amplificarea prin intermediul RT-PCR Marcarea cu agenţi fluorescenţi Hibridarea cu ADN fixat în micocipuri Analiza rezultatelor 5
Tehnica Southern-blot Bazată pe RFLPs Hibridizare cu sonde marcate Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un suport solid (pe membrane de nitroceluloză) Hibridarea acizilor nucleici Unirea complementară a fragmentelor (moleculelor) de acizi nucleici: ADN de cercetat cu sonda oligonucleotidică În reacţie participă molecule monocatenare Moleculele ADN-ţintă sunt fixate Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv sau fluorescent Identificarea complexelor hibride se realizează prin intermediul autoradiografiei Tehnica Southern-blot Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN Utilizarea tehnicii Southern-blot Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari Identificarea mutaţiilor punctiforme ce afectează SR Dactiloscopia genomică RFLPs Denaturarea şi transferul ADN pe membrane Hibridare cu sonda Autoradiografia Vizualizarea şi interpretarea rezultatelor RFLPs şi analiza genotipului Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2 C (mm) B (Nm) A (NN) Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C 6
Avantajele Southern-blot Este metodă foarte precisă Nu necesită cunoaşterea secvenţei nucleotidice analizate Nu necesită primeri sintetici Dezavantajele Southern-blot Necesită cunoaşterea hărţii de restricţie a genei ţintă Necesită cantităţi mari de material biologic Metodă îndelungată, cu multe etape Necesită izotopi radioactivi Necesită materiale costisitoare Tehnica Northernblot Extragerea ARN din ţesutul ţintă Electroforeza ARN în condiţii de denaturare Transfer pe membrană de nailon Hibridarea cu sonda marcată Autoradiografia Tehnica Northern-blot Extragerea ARN Transferul ARN pe membrane Hibridare cu sonda Electroforeza ARN Autoradiografia Vizualizarea şi interpretarea rezultatelor Utilizarea tehnicii Northern-blot Identificarea expresiei genice în anumite ţesuturi, anumite condiţii Identificarea variantei de splicing a proarnm Identificarea nivelului de expresie Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri) Identificarea nivelului de expresie şi a variantei de splicing 7
Secvenţierea ADN Stabilirea secvenţei de nucleotide Metoda chimică (tehnica Maxam-Gilbert, 1973) Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975) Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi) Tehnica dideoxi Sinteza enzimatică a ADN Utilizarea în paralel a nucleotidelor ce conţin deoxiriboză şi dideoxiriboză Stoparea sintezei în cazul incorporării ddntp 5 -ATTACAAGATTACCATGT-3 catena codogenă catena anticodogenă (matriţă) 5 -ATTAC-3 5 -ATTACA-3 5 -ATTACAA-3 5 -ATTACAAG-3 5 -ATTACAAGA-3 5 -ATTACAAGAT-3 5 -ATTACAAGATT-3 5 -ATTA -- primer marcat P 32 pentru ADN-polimerază A, T, C, T dntp (2 -dntp) pentru sinteza noilor catene A, T, C, T ddntp (2,3 -ddntp) pentru stoparea sintezei A T G C 5 -ATTACA-3 5 -ATTACAA-3 5 -ATTACAAGA-3 5 -ATTACAAGATTA-3 5 -ATTACAAGATTACCA-3 5 -ATTACAAGAT-3 5 -ATTACAAGATT-3 5 -ATTACAAGATTACCAT-3 5 -ATTACAAGATTACCATGT-3 5 -ATTACAAG-3 5 -ATTACAAGATTACCATG-3 5 -ATTAC-3 5 -ATTACAAGATTAC-3 5 -ATTACAAGATTACC-3 A T C G - + 5 -ATTACAAGATTACCATGT-3 - Tehnica dideoxi Extragerea ADN Denaturarea ADN (+) 5' TAAATGGCTA...3'(-) Sinteza catenelor complementare utilizând primeri marcaţi cu 32 P în prezenţa dntp şi ddntp Electroforeza în condiţii de denaturare Vizualizarea fragmentelor marcate prin autoradiografie + 8
Metoda automată Hibridarea in situ Pregătirea preparatelor de cromozomi Denaturarea ADN Hibridarea cu sonda marcată Vizualizarea la microscopul optic Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ADN Hibridarea in situ pentru depistarea secvenţelor ARN Hibridarea in situ cu utilizarea preparatelor de cromozomi metafazici Hibridarea in situ cu utilizarea preparatelor cu nuclei interfazici Hibridarea in situ cu utilizarea probei sens (stânga) şi antisens (dreapta) Analiza histochimică identificarea proteinelor în ţesut 9
Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici: Cercetare secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor patologii severe. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.). Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor infecţioase. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în criminalistică. 10