Sisteme de monitorizare a efectelor unor nano-oxizi in descompunerea speciilor reactive ale oxigenului (SRO) din procese de interes biologic ETAPA DE EXECUTIE NR. II Studiul efectelor nanopulberilor oxidice in reactii de degradare a SRO de importanta fiziologica. Obiectivul general al proiectului Realizarea unui sistem de monitorizare a efectelor pe care oxizii nanostructurati le au in descompunerea speciilor reactive ale oxigenului (SRO) si a lipoperoxizilor, cu dubla aplicabilitate: ca instrument de diagnoza precoce corelat cu nivelele de concentratie ale SRO si respectiv, de catalizator in degradarea compusilor cu risc biologic de tip SRO Obiectivele fazei de executie II Studiul proprietatilor nanopulberilor oxidice in reactii de degradare a superoxidului si oxigenului singlet implicate in reactii metabolice. Stabilirea modelului experimental de evaluare a capacitatii NPOx de degradare a SROstudii preliminare. Rezumatul etapei-rezultate semnifcative In conditii fiziologice, speciile reactive ale oxigenului (SRO) sunt produse in cantitate mica in celule. Cantitatile variabile ale acestor specii in cadrul organismelor vii pot cauza modificari celulare majore cu repercusiuni importante asupra statusului general. Electronii existenti la nivel mitocondrial constituie principala cauza de formare a speciilor reactive ale oxigenului, ca urmare a reactiilor ce au loc in lantul respirator si care genereaza aceste specii reactive ca si produsi secundari de reactie. Pana acum au fost identificate la nivel celular 10 tipuri de specii reactive ale oxigenului. Procesul general prin care se formeaza acesti radicali liberi este cunoscut sub numele de stres oxidativ. Stresul oxidativ este implicat in numeroase patologii, cum sunt: procesul de imbatranire si tulburarile asociate varstei, bolile neurodegenerative (Parkinson si Alzheimer). 1
Printre SRO cel mai des intalnite la nivel fiziologic se numara radicalul superoxid, apa oxigenata, radicalul hidroxil si oxigenul singlet, parte dintre acestia devenind si obiectul de studiu in etapa actuala de realizare a proiectului. Oxigenul singlet, desi nu este un radical liber in adevaratul sens al cuvantului, reactioneaza puternic cu un numar mare de biomolecule, indeosebi cu cele continand legaturi duble. Are un timp de injumatatire scurt in apa si este implicat in oxidarea lipoproteinelor cu densitate joasa. Avand in vedere importanta mentinerii echilibrului intre speciile reactiv ale oxigenului generate in procesele fiziologice si aportul de antioxidanti astfel incat nivelul concentratiei de SRO sa fie sub cel minim care initiaza destructurarile celulare, s-a incercat sinteza a numerosi compusi care sa poata fi utilizati ca si antioxidanti. In ultimii ani utilizarea nano-particulelor de tip oxid complex in descompunerea speciilor reactive ale oxigenului a devenit extrem de studiata, mai ales datorita proprietatilor specifice nano-particulelor (ca dimensiune, posibilitati de biocompatibilizare, posibilitati de dirijare orientata catre tesuturi tinta) care asigura acestora o mai mare disponibilitate de a fi eficiente exact in acele puncte critice unde concentratia SRO devine critica. Datorita proprietatilor fizice si chimice particulare ale nanopulberilor, acestea au devenit subiectul de studiu in cadrul multor domenii precum: aplicatii industriale, studii de toxicitate asupra mediului si impactul asupra sanatatii umane. Eficacitatea nanopulberilor de CeO 2 de a degrada SRO a fost demonstrata prin studii in vivo. Desi nu se cunoaste exact tipul de proces ce sta la baza degradarii radicalilor liberi de catre nanopulberile de CeO 2, se poate presupune ca mecanismul seamana cu cel ce are loc in sistemele non-biologice. Astfel se crede ca radicalii liberi intracelulari se comporta drept intermediari in schimbul de oxigen la suprafata nanoparticulelor si in final migreaza in golurile de oxigen ale nanoparticulelor de CeO 2. Mai mult, oxidul de ceriu tinde sa se comporte precum un compus nestoechiometric avand atomul de ceriu caracterizat de starile de oxidare +4 si +3. Studii recente de XPS au scos in evidenta faptul ca concentratia atomilor de Ce 3+ fata de cea a atomilor de Ce 4+ creste cu scaderea dimensiunii nanoparticulelor. Coexistenta celor doua stari de oxidare presupune faptul ca nanoparticulele au goluri de oxigen sau defecte de retea. Capacitatea antioxidanta a Mn(II) este corelata cu capacitatea acestuia de a degrada radicalii peroxil in conformitate cu schema 2. Reactia de degradare a radicalilor peroxil Pornind de la toate aceste date demonstrate si publicate, si tinand seama si de rezultatele obtinute in etapa anterioara atunci cand s-a utilizat ca sistem de studiu electrodul pasta de carbune modificat cu oxizi micsti de Co si La, studiile din aceasta etapa s-au efectuat utilizand tehnici 2
electrochimice si au continuat activitatea inceputa in prima etapa de realizare a proiectului si anume cea de determinare a comportarii nano-oxizilor de interes pe domeniul anodic de potentiale, avand ca finalitate preconizata evaluarea capacitatii acestor nanopulberi oxidice de a descompune specii reactive ale oxigenului. In aceasta etapa s-au studiat efectele nanopulberilor oxidice de Ce, Fe si Mn in reactiile de degradare a SRO atat ca atare cat si biocompatibilizate cu un strat de alginat de calciu, in raport cu radicali liberi de tip superoxid, generat prin descompunerea apei oxigenate, cat si fata de radicali de tip hidroxil, generati termic prin utilizarea unui azo-initiator, 2,2 -Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride, AAPH. De asemenea, efectul antiradicalic a fost studiat si in raport cu capacitatea acestor nano-oxizi, ca atare si bio-compatibilizati, de a reactiona cu radicalul liber stabil ABTS +. Aceste ultime studii s-au efectuat spectrofotometric. In acest caz efectul antiradicalic s-a raportat la un compus utilizat ca standard, si anume Trolox (omologul hidrosolubil al vitaminei E), in ideea de a elabora un sistem de masura care sa permita stabilirea unei ordini a eficacitatii de descompunere a speciilor reactive ale oxigenului de catre nano-oxizii de interes sintetizati in acest proiect. Cation radicalul ABTS + a fost generat prin reactia dintre 2,2 -Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- acid sulfonic) sare de diamoniu (ABTS) si persulfatul de amoniu. Determinarea efectului antiradicalic - Metoda ABTS + Generarea radicalului cationic ABTS [2,2 -azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] reprezinta baza uneia dintre metodele spectrofotometrice aplicate pentru determinarea capacitatii antioxidante totale. Radicalul cationic ABTS este produs in urma reactiei dintre ABTS si persulfatul de potasiu. Acest radical prezinta maxime de absorptie la lungimile de unda de 415 nm, 645 nm, 734 nm si 815 nm. Aditia antioxidantilor in solutia de ABTS + duce la reducerea radicalului la ABTS, direct proportional cu concentratia antioxidantului si durata reactiei. Asadar, determinarile au fost realizate la lungimea de unda fixa de 735 2 nm, lungime de unda la care cationul radicalic ABTS + prezinta maximul de absorbanta, fata de apa distilata ca proba martor. Astfel, in cuva s-au adaugat 2,5 ml ABTS (1,75 x 10-4 M) si 0,5 ml solvent pentru masurarea absorbantei blank-ului, iar in cazul masurarii absorbantei standardului si a probelor s-au adaugat 2,5 ml ABTS (1,75 x 10-4 M), 0,4 ml solvent si 0,1 ml standard sau proba. Rezultatele au fost calculate in conformitate cu urmatorul algoritm de calcul, capacitatea antioxidanta fiind exprimata in echivalenti moli Trolox: 3
TEAC proba C Trolox xfx A A proba Trolox A A blank blank unde - A blank reprezinta maximul absorbantei, citita la 3 minute dupa adaugarea a 2,5 ml ABTS, intro celula continand 0,5 ml apa distilata; - A Trolox reprezinta maximul absorbantei, citita la 3 minute dupa adugarea a 0,1 ml Trolox (10-3 M), inbtr-o celula continand 2,5 ml ABTS si 0,4 ml apa distilata; - A sample reprezinta maximul absorbantei, citita la 3 minute dupa adugarea a 0,1 ml proba (aproximativ 2 mg/ml), inbtr-o celula continand 2,5 ml ABTS si 0,4 ml apa distilata; - f reprezinta factorul de dilutie al probei; - C Trolox reprezinta concentratia efectiva de Trolox, in µmol L -1. In ciuda faptului ca radicalul cation ABTS nu este un radical prezent la nivel fiziologic, s-au efectuat totusi aceste determinari deosrece metoda ABTS reprezinta o metoda clasica de determinare a capacitatii antioxidante a compusilor capabili de a dona un atom de hidrogen sau a caror structura permite delocalizarea unui electron in urma careia radicalul ABTS se transforma in ABTS, si, in plus, aceasta metoda permita o normalizare a rezultatelor in raport cu un compus standard, Trolox-ul, ceea ce face mai usoara stabilirea unei ordini a eficacitatii si chiar si o incercare de standardizare a raspunsurilor obtinute. Asadar, nanoparticulele de interes au fost testate folosind aceasta metoda deoarece aceasta este metoda aleasa ca referinta in majoritatea cazurilor de determinare a capacitatii antioxidante. Trebuie mentionat ca in cazul oxidului de ceriu, trei tipuri de produsi de sinteza au fost testati, unul fiind cel comercial, cu dimensiuni ale particulelor ceva mai mari, de ordinul a 60 nm, celelalte doua tipuri de oxid de ceriu fiind sintetizate de catre partenerul P2. Oxidul de ceriu obtinut in proces de sinteza ce utilizeaza in etapele procesului sintetic bromura de hexadeciltrimetil amoniu (CTAB), are dimensiuni ale particulelor de 6-8 nm, si celalt oxid de ceriu, obtinut utilizand in sinteza acidul tartric (TA), are dimensiuni ale particulelor de 9-11 nm. In urma calcinarii nu mai exista urme de compusi organici in nanopulberile analizate. S-a constatat ca odata cu scaderea diametrului particulelor de oxid de ceriu eficienta antiradicalica a acestui compus este mai mare, rezultatele obtinute de noi fiind confirmate si de alte date de literatura care raporteaza aceeasi invers proportionalitate intre dimensiunea particulei de CeO 2 si eficienta sa in reactiile de descompunere a radicalilor. Astfel oxidul de ceriu commercial este cel mai putin activ, urmat de cel sintetizat utilizand TA, cel mai efficient fiind CeO 2 (CTAB). Desigur cresterea la aproape dublu a valorii TEAC nu se explica numai prin dimensiunea intrinseca a particulei, ci si prin caracteristicile lor superficiale (suprafata specifica si porozitate). 4
De asemenea, s-a observat ca in cazul oxidului de Mn se obtine si un efect sinergetic al proprietatilor antiradicalice prin bio-compatibilizare. Valoarea TEAC pentru MnO 2 -alginat este cu mult mai mare decat valoarea corespunzatoare numai alginatului ca atare (care are si el, ca atare, un efect antiradicalic semnificativ, luand in considerare valoarea TEAC obtinuta pentru alginat) respectiv numai MnO 2 ca atare, si, mai mult, este mai mare si decat suma celor doua valori, aceasta argumentand de fapt, efectul sinergetic. Ordinea in care nanopulberile oxidice reactioneaza cu radicalul ABTS Determinarea efectului antiradicalic fata de radicali superoxid. Analiza electrochimica folosind H 2 O 2 ca sistem generator de radicali liberi ai oxigenului Este binecunoscut faptul ca anumiti oxizi ai unor metale au capacitatea de a cataliza descompunerea apei oxigenate. Astfel, abilitatea de a degrada H 2 O 2 a nano oxizilor de Mn, si Ce, amestec de Fe si Co a fost determinata electrochimic folosind ca metoda cronoamperometria, masurand efectele de descompunere prin monitorizarea raspunsului specific pentru apa oxigenata, de la +0.650 V. Efectul de descompunere exercitat de catre nanopulberile oxidice s-a cuantificat ca diferenta intre semnalul inregistrat pentru apa oxigenata ca atare, la o concentratie de 2 mm si cel inregistrat pentru apa oxigenata dupa introducerea unei cantitati cantarite de nanopulbere in solutia de apa oxigenata de aceeasi concentratie, 2 mm. Diferenta intre intensitati este proportionala cu apa oxigenata dismutata de catre nanopulberile oxidice 5
Cronoamperogramele corespunzatoare H 2 O 2, 2mM (1), respectiv reactiei de descompunere a H 2 O 2 2mM de catre oxidul de Mn (2) Experimentele au fost efectuate in triplicat, rezultatele obtinute fiind exprimate in concetratie de H 2 O 2 degradata de catre compusul analizat. In acest caz diversi produsi de sinteza ai MnO 2 au fost studiati, in sinteza utilizandu-se rapoarte diferite solid: polivinilpirolidona (PVP), respectiv solid polietilenglicol (PEG) si, de asemenea, PVP de concentratii molare variate. Efectul de descompunere a H 2 O 2 masurat prin cronoamperometrie Compus Cantitatea de H 2 O 2 degradata (µm) MnO 2 - PVP 1/10 172 MnO 2 - PVP 1/1 0,2 M 153,68 MnO 2 - PVP 1/1 0,5 M 122,36 MnO 2 - PEG 1/5 101,46 MnO 2 - PVP 1/5 0,1 M 171,16 MnO 2 - PVP 1/5 0,2 M 5 grade 107,16 MnO 2 - PVP 1/5 0,5 M 67,24 CeO 2 - comercial 29,74 6
CeO 2 - TA 33,96 CeO 2 - CTAB 40,12 CoFe 2 O 4 10,21 Din tabelul de mai sus de poate observa ca nano oxizii de Mn prezinta cea mai mare putere de degradare a apei oxigenate, datorita capacitatii Mn de a cataliza descompunerea H 2 O 2. Cu exceptia utilizarii unei concentratii de PVP de 0,5M in raport de 5:1 PVP: solid, toate celelalte rezultate sunt comparabile pentru toate probele continand Mn, ceea ce demonstreaza ca oricare dintre variantele de sinteza si functionalizare va fi utilizata, se vor obtine NP eficiente in descompunerea SRO. CoFe 2 O 4 prezinta cea mai mica capacitate antioxidanta impotriva H 2 O 2, probabil datorita structurii retelei obtinute, care este o structura cristalina. In aceleasi timp rezultatele pentru oxizii de ceriu demonstreaza o eficienta destul de buna a acestora, ordinea eficacitatii de descompunere fiind, de asemenea, dictata de dimensiunea particulelor si de caracteristicile de suprafata. Determinarea efectului antiradicalic fata de radicali peroxid. Analiza electrochimica folosind AAPH ca sistem generator de radicali liberi Cel de al treilea model experimental utilizat pentru stabilirea efectelor nanopulberilor oxidice NPOx in reactia de descompunere a SRO de la nivel fiziologic s-a bazat pe utilizarea unui azo-initiator de radicali liberi, AAPH, care, in conditii controlate de temperatura, genereaza o cantitate constanta de radicali liberi HO pe minut, in solutii apoase. Metoda dezvoltata a vizat cuantificarea cantatitii de radicali peroxil descompusi de catre nano oxizii de Ce. Aceasta este proportionala cu scaderea intensitatii curentului de pic caracteristic radicalilor peroxi, in prezenta oxidului de ceriu. (vezi figura 3, 4). Nano oxizii de Ce, avand defecte de retea sunt capabili sa reactioneze cu SRO, ducand la degradarea acestora. RN NR 370 C [ R N 2 R] - N 2 2R 2O 2 2ROO Schema producerii radicalilor peroxil din AAPH In continuare, pentru a putea evalua abilitatea nano oxizilor de Ce de a degrada radicalii peroxil, s-a utilizat cronoamperometria, rezultatele fiind listate in tabelul 3. Se poate observa ca CeO 2 obtinut de la Sigma-Aldrich nu are aceiasi capacitate de a degrada radicalii peroxil cum au CeO 2 homemade. Efectul de descompunere a radicalilor peroxid de catre CeO2 Cantitatea de radicali peroxil Compus degradata (µm) 7
CeO 2 comercial 4,64 CeO 2 TA 6,85 CeO 2 - CTAB 6,42 8