Descrierea priectului Priectul structurat pe durata de 36 de luni, isi prpune realizarea unui sistem bi-mimetic aplicabil in analiza speciilr reactive radicalice. Dezvltarea sistemului bi-mimetic se face pe baza de depunerii de lipprteine umane (de densitate mica si farte mica) pe nanparticule metalice (aur), care, ulterir sunt atasate sau depuse pe un suprt slid (aur/ito) cnductr, intr- structura de tip senzr. In prezenta radicalilr liberi se prduc mdificari structurale ale structurii lipprteinelr (de exemplu la actiunea speciilr radicalice xigenate se initieaza lipperxidarea) care sunt crelate cu cncentratia de radicali liberi din sistemul de analiza, si care genereaza un semnal masurabil de natura electrica (intensitatea curentului) sau ca variatie de frecventa datrita mdificarii masei stratului depus (QCM). Infrmatia va fi cuantificata ca diferenta intre semnalul inregistrat la nivelul sistemului bi-mimetic in absenta speciilr reactive (numit referential, definit drept faza nrmala si utilizat ca martr/blank) si cel inregistrat in prezenta speciilr reactive ale xigenului (numit indicatr, definit drept faza de risc bilgic). Sistemul astfel dezvltat va fi aplicat la analiza speciilr radicalice din prbe de gaze si/sau prbe bilgice. Sistemul bi-mimetic realizat va fi validat in termeni de dmeniu de aplicabilitate, lineritate, sensibilitate (limita de detectie), acuratete, rbustete, repetabilitate. Echipa de cercetare a priectului Directr de priect: Dr. Simna Litescu Membrii echipei de cercetare: Prf. Dr. G.L. RADU Dr. Bgdan Bucur Eremia Sandra Ana-Maria Victria - dctrand UPB (teza sustinuta in februarie 2010) Penu Ramna - dctrand UPB Tache Andreia - dctrand UPB Matei Alina - dctrand UPB Gradul de implicare a tinerilr cercetatri Pe tata derularea priectului, tinerii cercetatri dctranzi UPB au fst implicati 100% in realizarea priectului pe periada in care activitatile lr de cercetare s-au desfasurat in labratarele Centrului de Bianaliza, bugetul alcat acestra asigurand cheltuielile salariale in prcent de 100% pe periada respectiva, iar cheltuielile de lgistica au asigurat buna desfasurare a activitatilr de tip CD. Dctrand Tache Andreia, isi elabreaza teza de dctrat intitulata "Studiul efectelr radicalilr liberi asupra mdificarilr structurale si functinale ale cmpnentelr prteice ale peretelui celular". Activitatea sa de cercetare vizeaza caracterizarea structurala si functinala a cmpnentelr lip-prteice de tip lipprteine de densitate mare si, respectiv de densitate mica ca si a aplipprteinei B in prezenta si in absenta unr radicali liberi, pentru a stabili cnditiile de raspuns analitic specific si mdul de cuantificare a efectelr radicalilr liberi, mai ales specii reactive ale xigenului. In desfasurarea activitatilr de CD utilizeaza tehnici de tip MALDI-TF, tehnica pentru care a beneficiat de un training al furnizrului de echipamente efectuat in mai 2009 in Centrul de Bianaliza; tehnici XPS -pentru care a beneficiat de un stagiu de training in 2008 la Universitatea de Studii din Bari; tehnici de tip FTIR, trainingul fiind asigurat de catre cercetatrii cu experienta din cadrul Centrului de Bianaliza si tehnici electrchimice - training asigurat la nivelul Centrului. Este acum in faza de validare a rezultatelr btinute in cuantificarea efectelr ncive ale radicalilr liberi de tip specii reactive ale xigenului, utilizand varianta ptimizata a mdelului elabrat. Data prevazuta pentru sustinerea tezei, niembrie 2010. Dctrand Penu Ramna, isi elabreaza teza de dctrat intitulata "Aplicatii analitice ale sistemelr bi-mimetice cu suprafete mdificate", si, dupa cum este evident, activitatea sa de cercetare vizeaza realizarea, caracterizarea si elabrarea mdelelr bi-mimetice prnind de la nanparticule si flii cnductive (Au, ITO) mdificate cu sisteme lipprteice, sisteme ce au rlul de a simula in cnditii de labratr cmprtarea cmpnentelr cmplexe ale membranelr celulare supuse stresului xidativ indus de radicali liberi. Tehnicile analitice utilizate sunt electrchimice si spectrmetrice, in particular spectrmetrie FTIR. Dctrand Eremia Sandra - si-a elabrat, pe periada derularii priectului, in ctutela, teza de dctrat intitulata "Determinatin f antixidant cmpunds frm vegetal prducts", sustinuta public in data de 02 februarie 2010. Activitatea sa in cadrul priectului a vizat si vizeaza elabrarea de metde si realizarea de experimente utilizand tehnici de flurescenta si tehnici electrchimice pentru cuantificarea si evaluarea cmparativa a efectelr induse de catre radicalii liberi -specii ale xigenului-, in vederea validarii rezultatelr btinute utilizand sistemul bimimetic dezvltat.
Dctrand Matei Alina, stagiu de elabrare a tezei de dctrat "Stabilitatea extractelr vegetale ale unr specii authtne, in cnditii induse de stress" si-a desfasurat parte din activitatea de cercetare in cadrul echipei pentru realizarea studiilr de stress xidativ indus de catre radicalii liberi ai xigenului. Actualmente activitatea suspendata - cncediu maternitate. Obiective si activitati si gradul de realizare OBIECTIVUL I Principalul biectiv, stiintific, al priectului este acela de a realiza un sistem bi-mimetic aplicabil in analiza speciilr reactive radicalice. Sistemul cnceput va fi validat si aplicat in analiza de prbe reale. Realizarea biectivului principal implica urmatarele biective subsidiare: I.a. Realizarea sistemului bi-mimetic NP-LDL prin depunerea de lipprteine umane (de densitate mica si farte mica) pe nanparticule metalice (aur) I.b. Caracterizarea sistemului bi-mimetic AuNP-LDL btinut, utilizand tehnici de analiza structurala (ATR/FTIR, SEM, XPS) si functinala (electrchimic, FTIR, FFF, flurescenta, MALDI) I.c. Depunerea AuNP-LDL pe suprt slid (Aur/ITO) si determinarea caracteristicilr de raspuns. I.d. Optimizarea sistemului realizat I.e. Aplicarea sistemului realizat la analiza speciilr radicalice din prbe de gaze si/sau prbe bilgice. I.f. Validarea mdelului prpus de analiza a speciilr radicalice in termeni de dmeniu de aplicabilitate, lineritate, sensibilitate (limita de detectie), acuratete, rbustete, repetabilitate. OBIECTIVUL II Un alt biectiv imprtant al realizarii priectului il cnstituie frmarea de persnal de cercetare: II.a. activitati de frmare a trei tineri dctranzi; II.b. cresterea capabilitatilr de cercetare si a expertizei in dmeniu pentru pstdctranzi; II.c. dezvltarea capacitatii de lucru in echipe intenatinale a tinerilr cercetatri. Pentru realizarea acestui biectiv este semnat un acrd prin care sunt prevazute in 2009, 2010 si 2011 stagii de training la Universitatea de Studii din Bari, Italia. OBIECTIVUL III Diseminarea rezultatelr si cresterea excelentei stiintifice prin publicarea rezultatelr cercetarii in reviste ISI. Echipamente dispnibile SISTEM ELECTROCHIMIC EG&G PRINCETON APPLIED RESEARCH: galvanstat/ptentistat Mdel 273A cu accesrii: Mdel 303A, micrcell- kit mdel KO264, celula de culmetrie mdel 377A, system electrd disc rtitr RDE SISTEM ELECTROCHIMIC VOLTAMASTER- RADIOMETER, Vltalab PGZ 100; SPECTROMETRU FTIR BRUKER TENSOR 27 cu sisteme de lucru in transmitanta si echipat cu accesrii de Attenuated Ttal Reflectance (ATR) si de analiza cu varianta unghiulara, VAR cu psibilitati de rientare a unghiurilr intre 0 0 si 82 0 ; CROMATOGRAF HPLC JASCO, CU DETECTIE UV-VIS SI DE FLUORESCENTA; CROMATOGRAF DE LICHIDE (HPLC) SHIMADZU, detectie Dide array; MICROSCOP ELECTRONIC PHILIPS EM 208 S, 100 kv,lentile 0.45 nm (pint), magnitudine 35 x - 200000x; Sistem MALDI-TOF Shimadzu AXIMA. Stadiul realizarii priectului Obiective realizate 2009 Obiective etapa intermediara
1. Depunerea AuNP-LDL pe suprt slid (Aur respectiv ITO) si determinarea caracteristicilr de raspuns; 2. Optimizarea sistemului realizat; 3. Cresterea vizibilitatii in structurile de cercetare natinale si internatinale; cresterea cmpetentelr in dmeniul analizei structurale si functinale. Obiective etapa finala 4. Aplicarea sistemului bi-mimetic realizat la analiza speciilr radicalice din prbe; 5. Cresterea vizibilitatii in structurile de cercetare natinale si internatinale; cresterea cmpetentelr in dmeniul analizei structurale si functinale. Activitatile prevazute pentru realizarea biectivelr pe anul 2009 au fst structurate dupa cum urmeaza: A. activitati de cercetare-dezvltare (detaliate mai js) 1. Depunerea AuNP-LDL pe suprt slid (Aur respectiv ITO) si determinarea caracteristicilr de raspuns 1.1. Stabilirea sistemului de depunere a AuNP-LDL pe suprturi slide 1.2. Stabilirea cnditiilr peratinale electrchimic 1.3. Stabilirea dmeniului de raspuns, sensibilitatii, selectivitatii, stabilitatii de stcare si peratinale 2. Optimizarea sistemului realizat 2.1.Stabilirea si ptimizarea cnditiilr peratinale QCM 2.2. Optimizarea cnditiilr de btinere a sistemului AuNP-LDL; stabilirea parametrilr de raspuns btinuti 2.3. Imbunatarirea selectivitatii si sensibilitatii 3. Aplicarea sistemului bi-mimetic realizat la analiza speciilr radicalice din prbe 3.1.Stabilirea dmeniilr de aplicabilitate; 3.2. Stabilirea rbustetei sistemului bi-mimetic realizat. B. Activitati de frmare a tinerilr cercetatri: B.2. Intcmire raparte de activitate; evaluarea cmpetentelr dbandite C. Activitati de diseminare. article publicate, carti Vezi link-ul activ 2009- rezultate livrate. Rezumatul activitatilr de cercetare-dezvltare efectuate in anul 2009 Utilizand prcedura de imbilizare stabilita anterir (raprt 2008) in etapa intermediara, 2009, de executie a priectului s- au cntinuat studiile privind cnditiile de aplicabilitate ale sistemului bimimetic pe baza de lipprteine realizat in evaluarea atat a txicitatii directe a radicalilr liberi de tip specii reactive ale xigenului cat si a efectelr de activare sau inhibare a acestr efecte ncive in prezenta altr cmpusi care se gasesc de bicei la nivelul membranelr celulare, cum sunt metalele tranzitinale de tip 3d (indesebi Cu II) si glutatinul in frma sa redusa, respectiv xidata.studiile efectuate au fst atat electrchimice cat si FTIR si MALDi-TF. S-a realizat caracterizarea atat a straturilr de LDL ca atare, nesupuse stresului xidativ cat si asupra straturilr lipprteice atacate de specii radicalice ale xigenului pentru a se elucida unele dintre punctele critice aparute in experimentarile anteriare, puncte critice care afecteaza stabilirea unui prtcl ptim de depunere a lipprteinelr, si care sunt: a. raspunsul caracterizat de valare relativ ridicata a deviatiei relative standard pentru raspunsurile electrchimice in cazul unr determinari efectuate in aceleasi cnditii de reactie, in ciuda faptului ca, statistic, mdelul bimimetic elabrat este utilizabil in determinarea efectelr ncive ale radicalilr liberi de tip hidrxil HO. si perxidicmai crect spus lip-perxidic (rezultatele electrchimice au dvedit a avea acelasi trend ca si cele btinute prin spectrmetrie de flurescenta, metda de flurescenta fiind dintre metdele clasice de evaluare a ncivitatii RL). b. depunerea nemgena a stratului de LDL, asa cum s-a demnstrat prin studiile de XPS efectuate anterir in raprt cu mgenitatea stratului in cmpzitia prbei la diferite adancimi de strat c. abrdarea studiului mdului in care evlueaza raspunsul sistemului bimimetic pe baza de LDL in medii de reactie cmplexe, in care se gasesc activatri, respectiv inhibitri ai reactiei de lipperxidare.
Iptezele aparute pentru a explica lipsa de reprductibilitate a raspunsului electrchimic inregistrat utilizand ca electrd de lucru sistemul bimimetic LDL-suprt slid cnductiv (LDL/Au flie, LDL-Aunanparticula/Au flie respectiv LDL- AuNP/ITO) au vizat mai multe aspecte, si anume, structural, mrflgic si functinal. Ca urmare, pentru indeplinirea biectivelr de cercetare din aceasta etapa de executie si anume determinarea caracteristicilr de raspuns ale sistemului bimimetic precum si ptimizarea sistemului, a devenit extrem de imprtanta elucidarea acestr ipteze si argumentarea slutiilr gasite pentru rezlvarea punctelr critice metinate anterir, ceea ce a determinat cncentrarea experimentelr pe analize structurale, mrflgice si functinale inaintea stabilirii parametrilr ptimi de raspuns. Urmare a slutinarii unra dintre punctele critice enumerate au fst gasite slutii pentru evitarea recristalizarii slutiilr saline in structura stratului depus prin diminuarea tariei inice si a mlaritatii slutiilr saline utilizate ca slvent, reusindu-se astfel evitarea aglutinarii lipprteinelr in jurul unr puncte de cristalizare. Flsirea nanparticulelr ca suprturi pentru imbilizarea lip-prteinelr determina crestere a raspunsului electrchimic asciat destructurarii lipprteice, mai crect spus asciat lip-perxidarii, de 3-5 ri, in functie de cncentratia de lipprteina utilizata pentru stabilizarea nanparticulelr (vezi tabelul de mai js). Semnalele au fst inregistrate in vltametrie ciclica utilizand ca electrd de lucru electrdul mdificat AuNP-LDL/Au, semnale crespunzatare curentului de pic specific lipperxizilr, si anume cele crespunzatare picului de la 0.385 V vs Ag/AgCl. Cncentratia de radicali HO generata in sistemul de lucru a fst cmpatibila cu nivelul fizilgic, si anume de 1, 7 µmll -1. Cresterea sensibilitatii raspunsului electrchimic al sistemului bimimetic dupa imbilizarea lipprteinelr in sistem AuNP I peak (E=0.385 V), na LDL (ppm) Electrd de Lucru = Electrd de lucru = LDL/Au AuNP-LDL/Au 20 108 324 40 250 800 50 302 1515 Pentru a dvedi fezabilitatea aplicarii sistemului bi-mimetic cnstruit in determinarea txicitatii asciate radicalilr liberi, a fst studiata frmarea lipperxizilr in urma atacului radicalilr liberi HO generati termic (cnfirmata de analizele FTIR ale straturilr de lipprteina deterirate) si in prezenta unr activatri ai reactiei de lip-perxidare, cum este Cu in starea de xidare II, ca si in prezenta unr inhibitri ai reactiei xidative si anume glutatinul in frma redusa, care jaca rl de antixidant endgen in majritatea prceselr intracelulare membranare. Studiile s-au efectuat ca si anterir, prin tehnici de caracterizare structurala si functinala. Pentru analiza structurala s-a utilizat spectrmetria de infrarsu cu transfrmata Furier in mdul de reflectanta, iar pentru analiza functinala s-au utilizat tehnicile de tip MALDI-TF si electrchimic. Datele FTIR au demnstrat ca prezenta Cu (II) determina intensificarea degradarii xidative a structurilr lipprteice, fiind afectata chiar si integritatea structurilr prteice, care in absenta reactiei degradative este mentinuta si dupa depunere (b ale grupărilr amidice); sunt afectate in special benzile specifice amida I, deplasandu-se de la 1654 cm -1 cu circa 25 nm, in timp ce benzile amida II raman nemdificate. In acelasi timp, creste semnificativ intensitatea benzii esterice de la 1738 cm -1 crespunzatare resturilr lipidice ale LDL imbilizat in prezenta radicalilr hidrxil. Se bserva, de asemenea, cresterea intensitatii benzilr specifice gruparilr perxidice din regiunea 3450-3700 cm -1. De asemenea, benzile din regiunea spectrala 3200 cm -1 3500 cm -1 devin mult mai largi si cu un aspect neregulat, prezenta legaturilr intramleculare specifice gruparilr perxi O-OH fiind evidente si farte clar cnfirmata prin mdificarea benzii de absrbtie a gruparilr ester din resturile lipidice de la 1740 cm -1 si de mdificarea benzii de absrbtie de la 917cm -1 cu deplasare catre 950 cm -1. Ca urmare, se pate spune ca mdelul bimimetic realizat este utilizabil si pentru evaluarea txicitatii radicalilr liberi asciate cu activatri ai reactiei de degradare, dvedindu-se sensibil la prezenta unr cncentratii de urme de Cu (II). Tt prin studii FTIR s-a demnstrat ca prezenta antixidantului endgen glutatin (GSH) asigura un anumit grad de prtectie a LDL imprtiva frmarii lipperxizilr cnsecutiv atacului radicalic, mentinandu-se intacte legaturile SH din GSH, cnservandu-se si frma si energia benzilr specifice OH, fiind bservabila dar usara largire a benzii HO legat in urma atacului radicalic, si farte mica deplasare a benzilr aceleiasi grupari catre numere de unda superiare. Datele MALDI-TF cnfirma datele FTIR. Astfel, s-a bservat in spectrele linear MALDI ca, in urma atacului radicalic, intensitatea fragmentului de masa mleculara 4394 Da scade cu 60 % fata de cea crespunzatare LDL nemdificat structural, de la 4403 Da; trebuie subliniat in cntext faptul ca prelucrarea semnalelr btinute se face cu tleranta de 20 Da pentru masa mleculara a iztpului cnsiderat semnificativ. Acelasi fenmen se inregistreaza si pentru fragmentele de masa mleculara 1561 Da, respectiv 9492 Da, ceea ce demnstreaza ca atacul radicalic de cncentratie de 1.7 micrmlar pe minut este extrem de bine evidentiat si psibil de urmarit experimental, argumentand
data in plus fezabilitatea sistemului bimimetic pe baza de LDL pentru evaluarea txicitatii generate de atacul speciilr reactive ale xigenului. Prezenta Cu(II) in sistemul de generare a reactiei xidative amplifica destructurarea, unele fragmente mleculare fiind cmplet absente, dvada in plus btinandu-se si dupa inregistrarea spectrelr de masa aferente LDL dupa atacul RL, slutie cu un cntinut micrmlar de Cu (II). Prnind de la rezultatele btinute anterir, in etapa finala pe 2009 s-a trecut la stabilirea dmeniului de aplicabilitate a mdelului realizat si la evaluarea rbustetei infrmatiei analitice, si implicit a sistemului bimimetic realizat. In cnfrmitate cu aplicabilitatea precnizata pentru mdelul bi-mimetic pe baza de liprprteine umane, stabilirea dmeniilr de aplicabilitate au vizat dua psibile utilizari: a. Aplicabilitatea mdelului la determinarea txicitatii directe a radicalilr liberi ai xigenului si definirea limitarilr mdelului b. Aplicabilitatea mdelului in determinarea efectelr radical scavenger sau pr-xidante ale unr cmpusi utilizati in tratamentul patlgiilr asciate cu stressul xidativ. Prnind de la una dintre cncluziile trase in celelalte etape de realizare a priectului, si anume ca, din punct de vedere functinal, mdelul bi-mimetic elabrat pate fi utilizat in stabilirea efectului reparatr sau preventiv al unr cmpusi cu prprietati antixidante, creland efectul preventiv cu reactiile cmpetitive pentru eliminarea radicalilr HO. (respectiv perxil) -mnitrizate prin picul specific de la + 0,95 vs Ag/AgCl (REF) - si, respectiv, creland efectul reparatr cu eliminarea lipperxizilr frmati mnitrizata prin picul specific de la 0,385V- in aceasta etapa s-au stabilit caracteristicile de sensibilitate si acuratete ale metdei de determinare dezvltate pe baza mdelului bi-mimetic elabrat. Nivelul de radicali liberi in celula de lucru a fst de 1.63x10-1 ml L -1 radical perxil per minut. Pentru a stabili sensibilitatea metdei in raprt cu cantitatea de lipperxizi frmati, s-a variat cncentratia de lipprteina depusa pe suprtul slid intre 14.6 ppm and 80.3 ppm, dearece cantiatea de lipperxizi este prprtinala cu cncentratia substratului. S-a cnstatat ca pentru cncentratii de LDL mai mici de 60 ppm se btine dependenta lineara intre semnalul asciat efectului txic al radicalilr liberi si cncentratia de substrat al reactiei de stress xidativ, deviatia standard a pantei fiind de 0,004 (pentru 5 determinari), dupa cum se bserva din figura 1, ecuatia dreptei de raspuns fiind i = 0,0885+0,051 (R=0,996). Urmare a necesitatii stabilirii dmeniului de aplicabilitate si a sensibilitatii de determinare pentru care pate fi utilizat mdelul bi-mimetic realizat, repetandu-se determinarile de 10 ri s-a btinut ecuatie de raspuns imbunatatita, si sensibilitate mai buna acestea fiind rezultatul aplicarii metdei ptimizate de depunere a lipprteinei si anume depunere din suspensie, la tarie inica redusa, utilizand suprturi mdificate cu nanparticule pentru cresterea sensibilitatii ( pentru detalii vezi sinteza lucrare etapa mai 2009). Ecuatia dreptei de raspuns este i = 170,8 xc + 55,4, limita de detectie (calculata ca 3xS/Z) fiind de 6.7 x 10-7 mll -1, ceea ce inseamna imbunatatirea sensibilitatii cu aprape un rdin de marime. Ca urmare, se pate cncluzina ca dmeniul de aplicabilitate al mdelului bi-mimetic elabrat este definit de sensibilitatea fata de nivelul de radicali liberi din sistemul de masura, limita de detectie fiind de 6.7 x 10-7 mll -1 si limitata de cncentratia suspensiei de substrat din care se face adsrbtia liprpteinei, care trebuie sa fie sub 60 ppm. Cele mai bune rezultate s-au btinut pentru sisteme depuse din suspensii de cncentratie de 40 ppm. Pentru definirea exacta a aplicabilitatii mdelului elabrat, s-au studiat care sunt factrii care limiteaza aplicarea sistemului bi-mimetic in evaluarea efectelr antixidante ale antixidantilr exgeni si endgeni. Astfel s-a stabilit ca: incubarea sistemului LDL-AuNP/Au in slutie de GSH 50 ppm inaintea atacului radicalic asigura prtectie a stratului lipprteic prin inducerea unei periade de lag a reactiei de lipperxidare de 30 de minute, dar efectul nu este crelabil in md clar cu cncentratia de GSH din slutie. Pe de alta parte, incubarea sistemului LDL-AuNP/Au in slutii de plifenli de diverse cncentratii, cnduce la intarziere a reactiei care depinde de cncentratia de antixidant exgen. In figura de mai js este exemplificat mdul de interactie al sistemului LDL-AuNP/Au cu acidul rsmarinic. Ca urmare a determinarilr efectuate in aceasta etapa de executie a priectului se pate spune ca: Dmeniul de aplicabilitate al mdelului bi-mimetic elabrat este definit de sensibilitatea fata de nivelul de radicali liberi din sistemul de masura, limita de detectie fiind de 6.7 x 10-7 mll -1. Aplicabilitatea mdelului este limitata de cncentratia suspensiei de substrat din care se face adsrbtia liprpteinei, care trebuie sa fie sub 60 ppm
Sistemul bimimetic realizat este extrem de sensibil, fiind aplicabil atat pentru determinarea txicitatii intrinseci (directe) a speciilr reactive ale xigenului, cat si a celei asciate cu factri care ptenteaza reactia degradativa, de tip metale 3d; trebuie subliniat insa ca, tcmai datrita acestei caracteristici exista si psibilitatea ca determinarile txicitatii directe a radicalilr liberi ai xigenului sa fie afectate de prezenta metalelr tranzitinale de tip 3d in stari de xidare superiare, cnducand la btinerea de valri fals pzitive. De asemenea, sistemul s-a dvedit fezabil pentru evaluarea efectului de prezervare a integritatii structurale a lipprteinelr depuse atat pentru antixidanti exgeni (surse alimentare de tip plifenli, uleiuri esentiale) cat si endgeni (GSH). Obiective realizate 2008 1. Realizarea sistemului bimimetic AuNP-LDL; 2. Caracterizarea sistemului bimimetic AuNP -LDL; 3. Cresterea vizibilitatii in structurile de cercetare natinale si internatinale; cresterea cmpetentelr in dmeniul analizei structurale si functinale. Etapa 2008 de realizare a priectului a fst structurata pe cele trei biective mentinate mai sus, care au implicat urmatarele activitati: A. activitati de cercetare-dezvltare (detaliate mai js) A.1.1. Depunerea lipprteinelr de densitate mica (LDL) si farte mica (VLDL) pe Au si Au-NP A.1.2. Sinteza NP stabilizate cu LDL A.1.3. Intcmire raparte de activitate; prcedura realizare sistem bi-mimetic A.2.1. Analiza structurala (ATR/FTIR, XPS) A.2.2 Analiza functinala (electrchimic, flurescenta, MALDI-TOF) B. Activitati de frmare a tinerilr cercetatri: B.1. Stagii training XPS efectuate la Universitatea din Bari, Departamentul de Chimie, dctrand Tache Andreia B.2. Intcmire raparte de activitate; evaluarea cmpetentelr dbandite C. Activitati de diseminare Diseminare rezultate: C1. Cnferinte: Cmunicare rala - Assessment f free radical ptential txicity using lipprtein bi-mimetic systems - OP38, 12th Internatinal Cnference n Electranalysis, ESEAC 2008, Chem Listyi, Praga, Cehia, 2008 Pster - Spectrscpic characterizatin f thin layers f lipprtein self-assembled films n gld electrdes and devices, XXI Cnvegn Nazinale Della Divisine di Chimica Analitica della Scieta Chimica Italiana, septembrie 2008 C2. Article ISI Inhibitin f Lw - Density Lipprtein Perxidatin by BHA use. Flurimetric Assay, Analytical Letters 41 (18), pp. 3253-3263 Genetic characterisatin f sme Rmania red-wines grape wine varieties, Prgress in Bimedical Optics and Imaging - Prceedings f SPIE 6991, art. n. 699128 Spectrflurmetric determinatin f cystine/cysteine rati and studies n Zn(II) influence - JBCS jurnal C3. Carte: Antixidanti-Metde de determinare si caracterizare-978-606-521-161- 2, Printech C4. 1 articl elabrat si trimis spre recenzie, editura Wiley & Sns Rezumatul activitatilr de cercetare-dezvltare efectuate in cadrul celei de a dua etape de realizare a priectului, etapa unica 2008 In urma experimentelr a fst elabrata prcedura de imbilizare a LDL pe suprturi de aur.
Caracterizarea analitica a sistemului s-a facut din punct de vedere structural prin tehnici XPS si Furier Transfrm InfraRed (FTIR) utilizand tehnica FTIR pentru unghi (de incidenta/de reflexie) variabil si functinal, utilizand tehnici electrchimice si de flurescenta. Caracterizarea analitica functinala si structurala s-a realizat atat pentru sistemele ca atare, praspat preparate cat si pentru sisteme supuse unui stress xidativ. Stressul xidativ a fst de dua tipuri, prin actiunea radicalului OH generat termic (37 0 C = t = 60 0 C) in slutii apase de AAPH (stc 4x10-2 mll -1 ) si prin xidarea in atmsfera (imbatranirea lipprteinelr). Analiza FTIR a cnfirmat ca depunerea stabila a stratului de LDL pe substratul de Au metalic se realizeaza prin intermediul legaturilr -SH, lipsa benzilr de absrbtie R-SH, -S-S- în regiunea 2500-2600 cm -1 fiind un argument care pledeaza pentru eficienta depunerii. Integritatea structurilr prteice si dupa depunere (ß ale gruparilr amidice) este dvedita de prezenta benzilr 1654 cm -1 (amida I) si, respectiv, 1541 cm -1 (amida II) ale LDL. Imprtante pentru cel de al dilea biectiv sunt mdificarile benzii esterice de la 1738 cm -1 ale resturilr lipidice ale LDL imbilizat in prezenta radicalilr hidrxil, ca si evidenta frmarii lipperxizilr, prezenat gruparilr respective fiind argumentata de benzile specifice gruparilr perxidice din regiunea 3450-3700 cm -1. Frmarea lipperxizilr in urma "atacului" radicalilr liberi generati termic a fst evidentiata prin analiza FTIR a straturilr de lipprteina deterirate. Dupa "atacul" cu AAPH, suprtul de aur mdificat cu LDL a fst uscat in atmsfera inerta si supus analizei FTIR, in care s-a bservat prezenta lipperxizilr, dvedita prin mdificarile din regiunea spectrala 3600 cm -1-3700 cm -1 din spectrele LDL (benzile de absrbtie intense si ascutite specifice gruparilr perxi O- OH aparute la 3613cm -1 si 3660-3700 cm -1 ), cnfirmata prin mdificarea benzii de absrbtie a gruparilr ester din resturile lipidice de la 1740 cm -1 si de mdificarea benzii de absrbtie de la 917cm -1. Analiza XPS este utila in argumentarea frmarii filmului de LDL la suprafata suprtului slid si in mnitrizarea mdificarilr cnfrmatinale ale mleculelr de LDL supuse prcesului de xidare. Din experimentele XPS s-a ajuns la cncluzia ca spectrul XP al atmilr de C, N si O reprezinta amprenta pentru lipprteina adsrbita pe suprturile slide. Semnalul atribuit N prvine dar de la prteina, in timp ce semnalele determinate de C si O cntin cntributii ale cntaminarii atmsferice. In urma analizei XPS rezulta ca depunerea stratului de LDL pe suprtul slid nu este mgena, in timp ce analiza la diferite unghiuri de incidenta cnduce la cncluzia ca exista mgenitate in cmpzitia prbei la diferite adancimi de strat. Datele XPS btinute au cnfirmat ca xidarea lipprteinelr de densitate mica depuse pe suprt slid este influentata de cmpzitia lipprteinei, de natura suprtului slid, de cnditiile de xidare. Rezultatele experimentelr electrchimice au dvedit ca mdelul bimimetic elabrat este utilizabil in determinarea efectelr ncive ale radicalilr liberi de tip HO si perxil. Rezultatele btinute prin tehnicile electrchimice au fst cnfirmate de cele btinute prin spectrmetrie de flurescenta. S-a elabrat intr-un stadiu preliminar si metda de caracterizare MALDI-Tf a lipprteinelr ca atare si a lipprteinelr xidate. Obiectiv realizat 2007 Stabilirea mdelelr experimentale de realizarea sistemului bi-mimetic NP-LDL prin depunerea de lipprteine umane de densitate mica (LDL) si farte mica (VLDL). Aceasta etapa de realizare a priectului a fst structurata pe trei activitati principale, dua dintre acestea implicand latura de cercetare-dezvltare (Stabilirea prtcalelr experimentale initiale de realizare si caracterizare analitica a sistemului NP-lipprteina; Experimente preliminare - pentru realizarea sistemului bi-mimetic respectiv), si una implicand asigurarea bazei lgistice pentru desfasurarea priectului.